热水解污泥酸化液碳氮磷对PHA合成的影响

贺 赟,李魁晓*,姜大伟,常 菁,郝 姗,王 刚,王佳伟

热水解污泥酸化液碳氮磷对PHA合成的影响

贺 赟1,2,李魁晓1,2*,姜大伟1,2,常 菁1,郝 姗1,王 刚1,2,王佳伟1,2

(1.北京城市排水集团有限责任公司,北京 100044；2.北京市污水资源化工程技术研究中心,北京 100124)

基于热水解污泥酸化液定向驯化得到了稳定的PHA合成混合菌体系,分析了菌群特征与结构,研究了限制氮、磷、非挥发性脂肪酸(non-VFAs)物质和补料方式对PHA合成率以及相关组分对菌群活性的影响.结果表明,利用热水解污泥酸化液合成PHA的特有混合菌体系中优势菌属短枝单胞菌属()占45%.限制酸化液中NH+ 4-N浓度PHA合成率从22wt%提高至25wt%,限制non-VFAs不仅PHA合成率可提升27%同时合成速率也提升了25%.酸化液中的NH+ 4-N、PO3- 4-P和non-VFAs未对PHA合成菌群活性造成显著影响,但是高浓度挥发性脂肪酸(VFAs)会对菌群活性造成抑制.为降低高浓度VFAs的抑制采取分批补料策略可提高PHA合成率,分批补料(5次)PHA最大合成率较一次补料的28wt%提升至34wt%.因此,通过提高酸化液中VFAs占比及优化补料方式均可提升PHA合成率,热水解污泥酸化液生物合成PHA在未来工业化生产时具有很大发展前景.

混合菌群；热水解污泥；聚羟基脂肪酸酯；挥发性脂肪酸

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一种可由微生物合成的性能良好、用途广泛的生物全降解塑料[1],降解后最终产物为水和CO2,可作为石油基塑料的替代品[2].当生长环境中碳源充足而必要的营养物质如氮、磷、镁等缺乏时,可促进细菌对PHA的合成[3-4].目前,PHA的工业规模化生产主要基于纯培养,纯培养过程主要利用葡萄糖、油类、有机酸等为原料,生产工艺中的原料及无菌过程大大增加了PHA生产成本从而制约其大规模应用[5～7].为了解决PHA生产原料与灭菌过程增加成本的问题,研究者利用各种废弃有机物及其水解产物代替精制原料作为碳源[7-8]降低生产原料费用、采用活性污泥中混合菌群代替纯菌种降低灭菌费用,从而消减PHA生产成本[9].

我国污水处理过程产生的剩余污泥体量巨大,其“污染”与“资源”属性共存,剩余污泥中有机质丰富,从剩余污泥中发酵获得挥发性脂肪酸(VFAs)是合成PHA的优良碳源[10-11],利用剩余污泥生产PHA可同时解决原料费用高和污泥资源化问题,具有较高的经济及环境效益[12].目前混合菌种利用污泥为基质的PHA合成率仅为20wt%～60wt%[10,12-13],而工业化生产中纯菌利用精制原料的PHA合成率>75wt%[14],PHA合成率低会增加后续提取废物及提取费用[15].为提高以污泥为基质的PHA合成率需提高污泥中有机质转化为VFAs的效率,相比碱性、超声、微波等预处理方式热水解是目前商业化最成熟的预处理方式[16-17].热水解预处理将污泥在160～ 180℃加热30～60min可通过破碎污泥絮体将胞内有机质溶解到液体中从而促进后续的污泥产酸[17-18].污泥热水解后发酵产酸的VFAs产量比原污泥提高44%～100%[16,19],因此利用热水解污泥酸化液合成PHA具有很好的应用前景.

热水解预处理提高酸化液中VFAs浓度的同时也提高了体系中氨氮、正磷酸盐及其他non- VFAs物质的浓度,这些non-VFAs由生物可降解有机物(如蛋白质和碳水化合物)和不易降解物质(如类黑素)组成,已被证明可用于细胞生长不利于PHA合成[20-21].现有研究缺乏对酸化液底物组分与生物合成PHA之间具体关联性的分析,相关组分对PHA合成的影响不明确.本研究以热水解污泥酸化液为底物,定向驯化PHA合成混合菌体系并分析其菌群特征,探讨不同组分浓度酸化液合成PHA的特征及其碳氮磷浓度对PHA合成及菌群活性的影响,并提出优化措施以提高PHA的合成率,旨在为热水解污泥合成PHA提出技术优化策略和理论指导.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 污泥来源 试验所需热水解污泥、活性污泥和厌氧消化污泥均取自北京某市政污水处理厂.

1.1.2 热水解污泥酸化液 在500L厌氧发酵罐参照Zhang等[16]的方法在35℃开展热水解污泥厌氧酸化,酸化污泥通过0.45μm陶瓷膜过滤后得到热水解污泥酸化液.

1.1.3 不同组分浓度热水解污泥酸化液 活性污泥在好氧条件对碳氮磷的需求C:N:P为100:5:1[22],研究者通过调控CNP比例(C:N为125～3333,C:P为250～66667)提升PHA合成率[19,22-23].调节热水解污泥酸化液pH值至11,在30℃用空气吹脱氨得到限制氮的酸化液(化学需氧量(COD):NH+ 4-N为187);调节pH值至9添加一定量MgCl2搅拌后离心得到限制磷的酸化液(COD:PO43--P为1873);配置与酸化液中VFAs比例一致的配水添加到酸化液中得到限制non-VFAs的酸化液(VFAs配水与酸化液体积比为3:1)[21].调节不同酸化液pH值至7备用.不同酸化液基本指标见表1.

表1 不同酸化液基本信息

1.2 方法

1.2.1 PHA合成菌群驯化方法 以热水解污泥酸化液为底物,以污水处理厂活性污泥为接种污泥,逐步提升底物浓度,参照Zhang等[16]以丰盛-饥饿模式(丰盛期碳源充足,饥饿期碳源匮乏)进行PHA合成菌群驯化,其中丰盛-饥饿期的时间比为1:3.

1.2.2 PHA合成方法 反应器为4个有效容积为5L的序批式反应器,底物为1.1.2所制备的酸化液,接种污泥为1.2.1驯化得到的合成菌群.控制接种量使初始污泥质量浓度为2000mg/L,丰盛期溶解氧控制在0.5～2mg/L,反应温度为30℃,一个PHA合成周期约1d(其中丰盛期约5h).

底物利用与PHA合成试验:底物为4种酸化液(表1)每天定时补料1次.定时取样测定VFAs、PHA、细胞干重(DCW)和三磷酸腺苷(ATP)等指标,其中ATP测定对照组为未添加酸化液的污泥质量浓度为2000mg/L的混合污泥.

分批补料PHA合成试验:底物为V组滤液,每天在丰盛期每隔1h补料1次共补料5次.定时取样测定VFAs、PHA和SCOD等指标.

1.2.3 VFAs浓度对菌群活性影响的测评方法 配置与酸化液中VFAs比例一致的配水,在4个2L烧杯(反应体积1L)中分别加入VFAs为250mg COD、625mg COD、1250mg COD、2500mg COD的配水,参照原始酸化液中碳氮磷比例以COD为250mg/L计算添加NH4Cl和KH2PO4至各烧杯中并调节pH值至7,加入混合菌群及蒸馏水调节初始污泥质量浓度为2000mg/L,定时取样测定体系ATP,其中ATP测定对照组参见1.2.2.

1.3 检测指标与方法

1.3.1 常规理化指标检测 COD测定使用快速消解分光光度法(DR3900,HACH,美国), TN、TP和正磷酸盐(PO3- 4-P)的测定参见[GB/T 11893-1989],氨氮(NH+ 4-N)的测定参见[HJ 535-2009].

1.3.2 VFAs及PHA检测 VFAs、PHA和DCW检测方法参见Jia等[11],其中乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的COD当量转化系数分别为:1.07、1.51、1.82和2.04.

1.3.3 ATP检测 ATP浓度可用于微生物受不同环境影响的活性评估[24],使用 Luminultra Technologies公司的 QuenchGone21 Wastewater (QG21W™)试剂包检测体系总ATP和胞外ATP,并计算胞内ATP质量浓度和生物威胁指数(BSI)[25].

1.3.4 混合菌群高通量测序 采用引物对338F(5'- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3')和806R(5'-GG- ACTACHVGGGTWTCTAAT-3')通过Illumina Miseq测序平台完成样品细菌16S rRNA高通量测序[26].

2 结果与讨论

2.1 PHA合成菌群特征

驯化前后细菌群落α多样性如表2所示.驯化前后样品中代表物种覆盖度的细菌群落Coverage均为0.99,表明本次测序结果代表了样本中细菌的真实情况.Observed OUTs(实际观察到的OUT数)和Chao指数与细菌的丰富度呈正相关,Shannon指数与微生物的多样性呈正相关.驯化后检测到的OUT数目较驯化前的1132减少到815,降低28.0%;驯化后细菌的Chao与Shannon指数也表现出相似的规律,分别下降29.6%和38.8%,表明通过定向驯化后混合菌群的细菌群落丰富度和多样性显著下降.驯化过程适应热水解污泥酸化液为底物而且能合成PHA的菌群得到大量增殖,而不适应底物及培养模式的微生物会被限制或逐渐淘汰[27].

表2 细菌群落α多样性

注:各列中字母表示统计分析的显著性,相同字母表示不显著,不同字母表示在=0.05水平上显著.

图1 驯化前后菌群结构

驯化前、后的混合菌群在门和属水平上的优势菌属相对丰度见图1(a)(b),驯化后优势菌门变形菌门(Proteobacteria)由29.16%增加到65.03%,驯化后优势菌属短枝单胞菌属()由0.82%增加到45.40%占据主导地位,属于Proteobacteria下的-变形菌纲(-proteobacteria);驯化前后样本中共有菌属占比40.06%,经过驯化混合菌群中还新增了23.66%的特有菌属(图1(c)).是典型的PHA合成菌属,在利用含VFAs的废水合成PHA的混合菌群中占优势地位[16,27-28].结果表明通过特定底物、培养方式可以驯化得到利用热水解污泥酸化液合成PHA以为优势菌属的混合菌群.

2.2 酸化液各组分浓度对PHA合成的影响

PHA在微生物体内的合成通常认为是由于生长不平衡导致的溢出代谢[3-4],为考察限制氮磷等营养物质对混合菌群合成PHA的影响,开展利用不同条件热水解污泥酸化液(限制NH+ 4-N、限制PO3- 4-P、限制non-VFAs)合成PHA研究,相关PHA合成情况见图2.

限制non-VFAs组的VFAs在4h内消耗完,其他组在5h内消耗完(图2(a)),表明non-VFAs的存在会影响体系对VFAs的利用,与Tu等[21]研究结果一致.4组试验NH+ 4-N和PO3- 4-P的利用情况如图2(b)(c)所示,高浓度NH+ 4-N组(原液与限制磷)在6h内对NH+ 4-N利用规律相似,去除约65mg/L NH+ 4-N,低浓度NH+ 4-N组(限制氮与限制non-VFAs)对NH+ 4-N利用不显著;高浓度PO3- 4-P组(原液与限制磷)在6h内对PO3- 4-P利用规律相似,去除约4mg/L PO3- 4-P,低浓度PO3- 4-P组(限制磷与限制non-VFAs)对PO3- 4-P利用不显著.这一结果与Tu等[29]研究结果类似,氮磷浓度较低时微生物合成PHA过程几乎不利于氮磷,低氮磷条件下(在本文中低NH+ 4-N为55mg/L及以下,低PO3- 4-P条件为4.5mg/L及以下)与之对应的微生物对氮磷的利用速率很缓慢.图2(d)展示了利用不同底物的PHA合成率,限氮组相比对照组将COD: NH+ 4-N由14提升至187与之对应的PHA最高合成率由22wt%提升至25wt%,限磷组的PHA最高合成率与对照组不存在显著性差异.许多研究表明,限制氮磷会促进PHA的合成[22,30],限磷组的PHA合成率未显著提升是因为对照组的磷已经较低COD:PO3- 4-P为239(为保障出水稳定达标,污水厂在生物池增加化学除磷,化学沉析产生的磷酸盐沉淀使污泥中微生物胞内磷浓度较生物除磷低),进一步限制磷并不能再提升PHA合成率[29].限制non-VFAs组的PHA合成率在3h达到峰值为28wt%显著高于其他3组且较对照组提升27%、合成速率较其他组缩短25%,本研究中限制non-VFAs组VFAs占COD的74%、其他3组仅占47%,占比超过30%的non-VFAs会降低PHA合成率,此结果与Jia等[20]研究一致,因为糖类和蛋白质等non-VFAs会促进细胞自身生长而不是合成PHA.在VFAs充足即碳源丰盛期细菌吸收VFAs合成PHA并在丰盛期末达到峰值,在VFAs匮乏即饥饿期细菌降解体内PHA维持生命活动(图2(a)(d)),PHA合成量达到峰值又下降的现象与多数研究一致[11,16,21,31].结果表明通过限制热水解污泥酸化液中NH+ 4-N浓度可提升PHA合成率,限制non-VFAs不仅可提升PHA合成率同时也能提升合成速率.

2.3 酸化液各组分浓度对菌群活性的影响

2.3.1 碳氮磷浓度对菌群活性的影响 为探究热水解污泥酸化液中高浓度营养元素(VFAs、non- VFAs、氮和磷等)是否影响菌群活性从而影响PHA合成,在PHA合成过程监测混合菌群ATP并计算得到体系胞内ATP及BSI见图3.

补料后体系胞内ATP由1200ng/mL降至约900ng/mL表明混合菌群活性变差,体系BSI由15%上升至21%表明混合菌群受到生物威胁指数变大,4组酸化液均对混合菌群造成了瞬时冲击、微生物受到抑制或死亡[24,32].4组酸化液对混合菌群胞内ATP及BSI的影响规律无显著性差异,4组体系的混合菌群活性均在1.5h恢复至补料前水平且活性持续上升至1400ng/mL、生物威胁对应下降至13%,表明在本研究中酸化液中的NH+ 4-N、PO3- 4-P、non-VFAs组分未对混合菌群造成显著的毒性抑制(本研究中NH+ 4-N浓度为240mg/L及以下,PO3- 4-P浓度为15mg/L及以下,non-VFAs/COD为48%及以上),有研究表明1500mg/L 氨氮会使厌氧消化系统微生物代谢受到抑制[33],本研究热水解污泥酸化液的氮磷浓度适于微生物代谢.

2.3.2 VFAs浓度对菌群活性的影响 根据上述实验,本研究酸化液中的NH+ 4-N、PO3- 4-P、non-VFAs组分未对混合菌群活性造成显著的影响,因此开展不同浓度VFAs对菌群活性影响的测评,结果如图4所示.

补料250和625mg COD/L VFAs后体系胞内ATP和BSI无显著变化,表明此质量浓度的VFAs未对混合菌群造成抑制影响.补料1250和2500mg COD/L VFAs后体系胞内ATP由1322ng/mL分别降至963ng/mL和650ng/mL,体系BSI由18%分别上升至21%和23%.结果表明高浓度的VFAs会使混合菌群活性受到抑制,有研究表明高浓度VFAs会抑制厌氧消化的微生物[34]且高浓度底物易使PHA合成菌群性能变差[35-36],后期可通过分批补料方式减少底物对体系的抑制以促进混合菌群活性[9].

2.4 补料方式对PHA合成的影响

Serafim等[9]研究表明,一次性补入高浓度底物会对微生物活性造成抑制,因此可通过分批补料的方式克服底物抑制.采用限制non-VFAs的热水解污泥酸化液作为底物,通过改变补料方式研究其对PHA合成的影响.在一个PHA合成周期内,酸化液经过5批次补料加入体系,结果如图5所示,酸化液中不易利用的COD逐渐累积,在6h VFAs被消耗完时仍有500mg 的累积,后续可通过在每一周期末排水以减少难利用COD的影响[31].经过5次补料后PHA合成率在5h达到峰值为34wt%(其中PHB:PHV为2.1),停止补料1h后菌体PHA质量分数下降(图5(b)).停止补料1h后底物中可利用碳源匮乏,菌群会消耗体内PHA维持生命活动导致菌体PHA质量分数下降,与2.2节结果及先前报道结果一致[11,16,21,31].分5次补料PHA最大合成率可达34wt%,结果表明采取分批补料可以提升体系PHA的最高合成率,此结果与Tu等[21]和Serafim等[9]的研究类似,通过分批次补料PHA合成率可提升20%～30%.

3 结论

3.1 基于热水解污泥酸化液定向驯化得到稳定的PHA合成混合菌体系,其中优势菌属短枝单胞菌属()占45%,此混菌体系中限制和淘汰了不能合成PHA的微生物因此细菌群落的丰富度和多样性相比驯化前显著下降.

3.2 利用不同条件热水解污泥酸化液(限制NH+ 4-N、限制PO3- 4-P、限制non-VFAs)合成PHA,限制酸化液中NH+ 4-N浓度PHA合成率从22wt%提高到25wt%,限制non-VFAs不仅PHA合成率可提升27%同时合成速率也提升了25%.

3.3 高浓度热水解污泥酸化液补料后会对体系造成瞬时冲击,本研究酸化液中的NH+ 4-N、PO3- 4-P、non-VFAs组分未对混合菌群活性造成显著的影响,但高浓度VFAs会对菌群活性造成抑制.

3.4 采取分批补料可提高体系PHA合成率,分批补料(5次)PHA最大合成率较一次补料的28wt%可提升至34wt%.

3.5 热水解污泥酸化液生物合成PHA工业化生产时可通过提高酸化液中VFAs占比及优化补料方式提升PHA合成率.

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Effects of carbon, nitrogen and phosphorus in fermented thermal-hydrolyzed sludge on polyhydroxyalkanoates production.

HE Yun1,2, LI Kui-xiao1,2*, JIANG Da-wei1,2, CHANG Jing1, HAO Shan1, WANG Gang1,2, WANG Jia-wei1,2

(1.Beijing Drainage Group Co., Ltd., Beijing 100044, China；2.Beijing Engineering Research Center of Wastewater Resource, Beijing 100124, China)., 2023,43(10)：5181～5187

Based on the domestication of the acid liquor of fermented thermal-hydrolyzed sludge, the mixed microbial cultures for producing PHA were obtained and its characteristics were explored. The influence mechanism of feeding method and composition (i.e., N, P, non-VFAs) of the acid liquor on the PHA yield and microbial activity were also investigated. Specifically, the predominant Brachymonas accounted for 45% of the unique mixed microbial cultures that yield PHA. The PHA productivity was improved from 22wt% to 25wt% by limiting the concentration of NH+ 4-N in the acid liquor. By limiting the concentration of non-VFAs, not only the PHA productivity was improved 27% but also the production efficiency was improved 25%. Microbial activity was not effected significantly by non-VFAs、NH+ 4-N and PO3- 4-P in acid liquor while was obviously restrained by volatile fatty acids (VFAs) with high concentration. To mitigate inhibition of VFAs and improve the PHA yield, intermittent feeding (5times) strategy was used. The PHA yield was effectively improved to 34wt% compared with 28wt% in disposable feeding. Furthermore, the PHA yield was improved by increasing the VFAs proportion in the acid liquor and optimizing the feeding method. The production of PHA by microorganism from fermented thermal-hydrolyzed sludge will be great promise in future industrialization.

mixed microbial cultures；thermal-hydrolyzed sludge；polyhydroxyalkanoates (PHA)；volatile fatty acids (VFAs)

X705

A

1000-6923(2023)10-5181-07

2023-02-24

* 责任作者, 教授级高级工程师, kuixiao_li@163.com

贺 赟(1992-),女,陕西西安人,工程师,硕士,主要从事污水治理与资源化研究.发表论文5篇.heyun1116@163.com.

贺 赟,李魁晓,姜大伟,等.热水解污泥酸化液碳氮磷对PHA合成的影响 [J]. 中国环境科学, 2023,43(10):5181-5187.

He Y, Li K X, Jiang D W, et al. Effects of carbon, nitrogen and phosphorus in fermented thermal-hydrolyzed sludge on polyhydroxyalkanoates production [J]. China Environmental Science, 2023,43(10):5181-5187.