DNA条形码在浙江省蜉蝣目稚虫昆虫多样性中的应用

高亚杰, 张立华, 陈 敏, 乐傅凯丽, 张加勇

(1.阿克苏职业技术学院, 新疆 阿克苏 843000; 2.泰顺县自然资源和规划局, 浙江 温州 325500; 3.永康市野生动植物保护管理站, 浙江 永康 321300; 4.浙江师范大学 生命科学学院, 浙江 金华 321004)

0 引言

【研究意义】蜉蝣目(Ephemeroptera)隶属于节肢动物门(Arthropoda)、六足总纲(Hexapoda)、昆虫纲(Insecta)。现今世界已报道的蜉蝣目昆虫有37科376属3 085种[1-3]。截止2022年10月,中国报道了21科307种蜉蝣,其中,台湾地区特有的58种,除去台湾特有种,大陆蜉蝣种类249种。浙江省蜉蝣种共有13科34属62种,其中,22种蜉蝣只报道了成虫单一阶段[4-17]。蜉蝣目昆虫是对水质最为敏感的三大水生昆虫(蜉蝣目、毛翅目、襀翅目)之一[18],同时蜉蝣是公认的可以应用于生态研究与生物监测研究的昆虫[19],在EPT法和全生物法等监测水质的主要方法中起重要作用。这类昆虫一般生活于未污染水体中[20],其稚虫是流动清洁水体的主要底栖昆虫,对水质中营养盐、重金属、温度、pH和溶解氧等极为敏感[21]。此外,不同种类的蜉蝣对水体耐污值不同,如细蜉科(Caenidae)突唇蜉属(Clypeocaenis)的蜉蝣耐污值较高;小蜉科(Ephemerellidae)天角蜉属(Uracanthella)、鲎蜉科(Prosopistomatidae)鲎蜉属(Prosopistoma)等蜉蝣耐污值较低。在水体质量的生物学评价工作中,蜉蝣目种类和数量的变动能准确反映水质的变化和污染程度,对蜉蝣目生物多样性的研究有利于水质监控的研究[22]。然而,蜉蝣种类的形态鉴定由于稚虫和成虫发育阶段差异、雌雄差别等难题,造成蜉蝣分类困难,需要大量的样本材料并经过专业训练的人员才能完成分类,从而制约了利用蜉蝣在水质监控中的应用。因此,在蜉蝣目昆虫多样性研究中应用分子手段将有积极意义。【前人研究进展】DNA条形码技术可以作为生物鉴别的一种快速补充工具,有效解决形态学鉴定的难题[23]。在昆虫分类中,DNA条形码技术得到广泛应用[24]。这种以序列为基础的鉴定方法可使研究者客观地获取数据,不受生物体发育阶段的影响[25],避免了稚虫和成虫形态差异大造成鉴定上的争议,有效弥补了形态学鉴定方法上的不足[26]。利用DNA条形码进行物种分类研究时,通常选择线粒体COI基因[27]。因其具母性遗传、基因重组率低、遗传差异高、进化速率快等优点[28-30]。COI基因在确定隐存物种方面也具有较多的应用,如STAHLS等[31]用COI条形码证明了蜉蝣目中存在的隐存多样性;张媛等[32]运用COI基因对鞘翅目昆虫探究了系统发育关系;STIGENBERG[33]通过28S和COI 2个分子标记发现了茧蜂的隐存种;FREY等[34]以COI序列为手段发现入侵物种实蝇中存在隐存复合体;张明等[35]利用COI基因片段结合雄性成虫尾器形态特征,对双翅目麻蝇属54个种30个亚属进行分类初步探明,各亚属的分类地位以及系统发育关系;YAAKOP等[36]探讨束蛾物种的生命周期时借助COI基因发现束蛾隐存种;FAILLA等[37]综合运用形态学与COI条形码的手段,试图鉴定几种未知蚊类幼虫的种类,最终确定这些幼虫是摇蚊科昆虫的幼虫。COI基因已被证明适用于大范围的生物类群的识别,并在水生昆虫中大量应用[38],特别在物种多样性研究中能够快速准确的鉴定,有效发现隐种。【研究切入点】DNA条形码技术不受生物体发育阶段的影响,使用标准化的分子标记进行物种准确鉴定的技术,利用序列作为标记与物种信息建立对应关系,弥补形态学鉴定的难题。【拟解决的关键问题】利用形态与分子相结合的方法分析浙江省内蜉蝣目稚虫昆虫多样性,并与之前浙江省已报道的蜉蝣目昆虫进行比较,以系统地了解浙江省蜉蝣目昆虫资源及其多样性,为开展利用蜉蝣监控浙江省各地水质状况奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

在浙江省各县市共设102个样点,含以往采集过蜉蝣的30样点。于2016年7月至2022年9月,利用踢网法采集蜉蝣。采集的蜉蝣置于85%酒精中保存,并将各蜉蝣样本的采集地点、采集时间、采集人等详细信息记录在册,并汇总制表。将样本带回实验室后,保存于-20 ℃冰箱内,以便后期鉴定使用。

1.2 方法

1.2.1 形态鉴定 在体视显微镜(Nikon SMZ800)下对采集到的各样本进行观察、解剖、形态鉴定并拍照。将鉴定后的蜉蝣按地点、科、属、种等分拣入不同的塑料小瓶中,置于-20 ℃冰箱内保存。

1.2.2 DNA提取 取形态鉴定到种的蜉蝣样品置于1.5 mL(或2 mL)Eppendorf 管中,使用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司生产]抽提总DNA(具体提取过程参照试剂盒说明书步骤进行),提取的DNA置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.3 PCR反应及测序 参照引物FY-C1-J-1751:GGDGCYCCHGAYATRGCNT TYCC,FY-C1-N-2329:ACDGTAAAYATR TGRTGDGCYCA[39]。PCR反应体系:10×PCR Buffer 5 μL,dNTP Mixture 5 μL,模板DNA 1 μL,上下游引物各2 μL,Taq酶(5 U/μL)0.25 μL,无菌水补至50 μL。在MJ-Mini PCR仪(BIO-RAD)或Eppendorf PCR仪上进行PCR反应,反应体系:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性50 s,48 ℃/46 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,35个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像仪扫描记录结果。PCR扩增产物委托上海生工切胶纯化、双向测序。对所获得的核苷酸序列进行密码子各位点碱基替换偏好性分析,排除核基因组中mtDNA假基因的可能。

1.2.4 遗传距离分析 将测序结果在DNAstar的SeqMan中进行相应序列校对。采用MAGE5.05对蜉蝣目不同种的COI序列进行比对,计算变异位点数、碱基含量,并以Kimura 2-parameter(K2p)为模型[40],计算各个已测序蜉蝣目样本间遗传距离。结合形态与分子的鉴定结果,统计浙江省蜉蝣的遗传多样性,分析形态学上鉴定的种类与分子(遗传距离)上鉴定种类是否存在差别以及产生这些差别的原因。

1.2.5 系统发生分析 选用石蛃昆虫作为外群,结合NCBI数据库已知蜉蝣的COI基因序列,以及在浙江省采集样本的COI基因序列(以FASTE格式保存),获得相应的数据集,采用Mega5.05软件,以Kimura 2-parameter为模型,包含转换和颠换,Gamma分布,其余默认参数,数据集构建邻接法(NJ)系统发生树[41]。

2 结果与分析

2.1 浙江省蜉蝣形态种类

基于形态鉴定后确立的蜉蝣种类44种(2个蜉蝣种由于分子数据不全,未统计),包括: 1)细裳蜉科:宽基蜉属(宜兴宽基蜉、安徽宽基蜉、面宽基蜉),柔裳蜉属(紫金柔裳蜉);2)四节蜉科:四节蜉属(红柱四节蜉、小刺四节蜉、黑斑四节蜉),丽翅蜉属(逸仙丽翅蜉、纳氏丽翅蜉);花翅蜉属(三刺花翅蜉)、假二翅蜉属(黑脉假二翅蜉、紫假二翅蜉),黑四节蜉属(紫眼黑四节蜉); 3)扁蜉科:扁蜉属(红背扁蜉、黑扁蜉),似动蜉属(斜纹似动蜉、红斑似动蜉、叉似动蜉、宜兴似动蜉),高翔蜉属(拟高翔蜉、何氏高翔蜉、大庸高翔蜉),赞蜉属(桶形赞蜉),扁蚴蜉属(皮氏扁蚴蜉),拟亚非蜉属(尤氏拟亚非蜉);4)小蜉科:小蜉属(天目山锐利蜉),锯形蜉属(景洪锯形蜉),大鳃蜉属(膨铗大鳃蜉、大茎大鳃蜉);5)越南蜉科:越南蜉属(大别山越南蜉、中华越南蜉、庆元越南蜉);6)等蜉科:等蜉属(江西等蜉);7)蜉蝣科:蜉蝣属(绢蜉、洪江蜉、长茎蜉、黑翅蜉);8)细蜉科:细蜉属(黑点细蜉、中华细蜉);宽基蜉属(粗铗宽基蜉);9)新蜉科:小河蜉属(埃氏小河蜉);10)古丝蜉科:古丝蜉属(中国古丝蜉);11)河花蜉科:河花蜉属(广西河花蜉、长胫河花蜉)。其中,小刺四节蜉、黑脉假二翅蜉、紫假二翅蜉、红背扁蜉、叉似动蜉、拟高翔蜉、皮氏扁蚴蜉、天目山锐利蜉、洪江蜉、长茎蜉、大庸高翔蜉、大茎大鳃蜉、黑翅蜉等13种蜉蝣是研究首次采集稚虫,国内未曾报道,有待后期补充相应的稚虫特征描述。

2.2 蜉蝣COI基因序列遗传距离

利用FY-J-1751和FY-N-2329通用引物PCR扩增并测序,共获得187条COI基因序列。剪去引物端序列,序列最终长度为600 bp,序列变异位点238个,简约信息位点230个。蜉蝣种内和种间遗传距离,去除大别山越南蜉和中华越南蜉蝣种间遗传距离为1.1%,小于10%外,其余种间遗传距离最小值为10.9%(长胫河花蜉和广西河花蜉之间),最大值为29.1%(红背扁蜉和紫眼黑四节蜉之间)。紫眼黑四节蜉的种内遗传分歧为9.8%,红柱四节蜉种内为11.0%,逸仙丽翅蜉种内为12.0%,其余种内的遗传距离平均值在0%～5.6%,其中,宜兴宽基蜉、黑扁蜉、斜纹似动蜉、斜纹似动蜉、红斑似动蜉、叉似动蜉、宜兴似动蜉、拟高翔蜉、何氏高翔蜉、大庸高翔蜉、尤氏拟亚非蜉、桶形赞蜉、景洪锯形蜉、大茎大鳃蜉、天目山锐利蜉、大别山越南蜉、江西等蜉、洪江蜉、长茎蜉、中华细蜉、长胫河花蜉、广西河花蜉的种内遗传分歧较小,为0%～3%;膨铗大鳃蜉、红背扁蜉、面宽基蜉的种内遗传分歧较大,为3.5%～5.6%。

2.3 蜉蝣基于COI基因序列构建系统发生树

如图1所示,在NJ系统发生树中,除逸仙丽翅蜉、紫眼黑四节蜉和红柱四节蜉之外的所有物种均为单系群,其中,中华越南蜉和大别山越南蜉具为一支系后再与庆元越南蜉形成姐妹群关系,而逸仙丽翅蜉、紫眼黑四节蜉和红柱四节蜉并不是单系性。逸仙丽翅蜉存在3个支系,紫眼黑四节蜉存在2个支系,紫眼黑四节蜉存在3个支系,表明3种蜉蝣存在隐种,其中,逸仙丽翅蜉存在2个隐存种,紫眼黑四节蜉存在1个隐有种,红柱四节蜉存在2个隐存种。

图1 基于600 bp 序列的COI DNA barcoding的蜉蝣邻接法(NJ)系统发生树

3 讨论

3.1 形态鉴定与分子数据结合分析鉴定物种的可靠性

在DNA barcoding分子数据上,除大别山越南蜉和中华越南蜉种间遗传距离为3.5%外,种间遗传距离为10.9%～29.1%。除逸仙丽翅蜉、紫眼黑四节蜉和红柱四节蜉外,其余物种内的遗传距离平均值一般在0%～5.6%。2003年,HEBERT等[27]利用COI基因序列分析遗传距离时,认为种内遗传距离一般不大于2%,但也存在一些大于2%的现象,同时发现同属种间的遗传距离是该属种内遗传距离的10倍左右。紫眼黑四节蜉种内遗传分歧为9.8%,红柱四节蜉种内为11.0%,逸仙丽翅蜉种内为12.0%,3种蜉蝣物种的种内遗传分歧极其接近或大于常规COI基因分歧度的10%,可以推测存在隐种[42-47]。结合系统发生树,紫眼黑四节蜉、逸仙丽翅蜉和红柱四节蜉并不是单系群,进一步证实其存在隐种。基于DNA barcoding的分析重新对这3个种类的蜉蝣进行形态鉴定,发现原先被鉴定成逸仙丽翅蜉的蜉蝣中,存在2个隐存种;被鉴定成红柱四节蜉的蜉蝣中存在2个隐存种;而原先被鉴定成紫眼黑四节蜉的蜉蝣中,存在个1隐存种。该5个隐存种有待从形态特征进行新种描述。大别山越南蜉和中华越南蜉的遗传分歧为1.1%,小于种间的10%标准[27],结合系统发生关系和对形态特征的重新鉴定后认为大别山越南蜉和中华越南蜉为同一物种,考虑大别山越南蜉的命名迟于中华越南蜉,按照命名法则命名优先权,认为大别山越南蜉为中华越南蜉的同物异名。综上所述,确定浙江各地采集到的蜉蝣共13个科,24个属,46种(包括44个已报道种、2个物种为同物异名种)。另外,其中5个物种存在隐种(有待发表)。

3.2 实际采集物种与浙江省已知物种存在差距的原因

在本研究中,通过采集浙江省各县市的蜉蝣,结合分子与形态鉴定发现,44种浙江省已报道种,其中,5种隐存种,同物异名1种,有18种浙江省已报道中未采集到稚虫样本,针对文献已报道浙江省蜉蝣物种为62种[17],而本研究仅采集到46种,有16种已知物种未采集到,可能原因包括以下几点:一是由于标本采集时间和采集点限制导致采集物种不全;二是浙江省已报道蜉蝣种多数报道于2001年前,距今时间间隔较久,环境污染可能引起某些蜉蝣物种生境改变,导致该种蜉蝣的存在范围缩小,导致在原采集地难以采集;三是某些已报道蜉蝣种类的生存环境为水深较深的河流或湖泊底部,而本研究中的蜉蝣采集,由于安全、资金、器械、时间等因素的限制,未到较大河流和湖泊采集,因此可能导致蜉蝣种类不全;四是采集工作主要针对稚虫采集未考虑用灯诱法采集,而灯诱法可以诱捕到飞翔能力强、活动范围广的成虫,浙江省已报道的蜉蝣种类更多是成虫。同时本研究发现了5种隐存种,后期需要加大采集样点,并采用灯诱法,利用不同采集时间对同一样地进行持续采集,以便采集到更多的蜉蝣物种。另外,发现浙江省蜉蝣昆虫资源较广,有待深入对浙江省蜉蝣资源进行调查研究,为后期开展浙江省各地水质监控研究奠定基础。

4 结论

采自浙江省44种蜉蝣稚虫的187条COI基因序列测定结果准确,44种蜉蝣目昆虫的种间、种内遗传距离及系统发育树结果说明,采用COI基因序列的DNA条形码技术能够对不同的蜉蝣目稚虫昆虫进行有效分类,能够发现隐种,与形态学鉴定结果相互佐证,在水生昆虫尤其是蜉蝣目昆虫多样性调查研究和水质监测中可发挥重要作用。