肝细胞源外泌体miRNAs在肝脂毒性发生过程中的作用

张道亮,王希春,吴金节,李 玉

(安徽农业大学 动物科技学院,安徽 合肥 230036)

高非酯化脂肪酸(nonestes-terified fatty acid,NEFA)血症是酮病的主要病理学特征之一,且高NEFA是引起肝脂毒性的主要原因,奶牛高NEFA血症环境下肝细胞产生的外泌体可能影响肝细胞的内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)和脂质凋亡,从而导致发生肝脂毒性。ERS是指细胞在生长物质摄入发生大幅度调整、糖基化作用、钙离子代谢紊乱、活性氧、缺氧和微生物感染等内源性和/或外源性影响因素的刺激下,细胞自我调节稳态的功能被损害,蛋白质处理与转运过程出现障碍,致使未折叠蛋白或错误折叠在其腔室内堆积,内质网的结构与功能受损,使细胞发动应激反应,以便内质网功能恢复并调节内环境动态平衡。泌乳早期奶牛主要的营养代谢紊乱性疾病,以出现NEFA血症为临床病理学特征,发生酮病的奶牛会表现出脂毒性肝损伤[1]。肝脏是奶牛酮病发生过程中的中心器官,同时也是NEFA产生的主要部位和肝脂毒性发生的主要器官。奶牛食欲下降,血糖浓度降低,脂肪代谢紊乱,高NEFA血症导致酮体产生增多,促发奶牛罹患子宫内膜炎、乳腺炎、创伤性网胃炎、真胃变位和免疫抑制,给奶牛养殖业造成巨大的经济损失[2]。外泌体作为细胞外囊泡之一,可从任意机体组织提取,在其外层脂质层内包裹有蛋白质、脂类物质、mRNA和miRNA以及其表面镶嵌的信号受体等进行远距离调控的细胞信使[3]。普遍认为外泌体可作为机体物质代谢与疾病状态的标志物,有研究表明,外泌体miRNA可用于治疗代谢性疾病[4-5]。但是,外泌体是否参与奶牛酮病脂毒性的发生过程及其导致脂毒性的具体机制尚未明确。在过去的研究结果中,酮病奶牛血浆源和肝组织源外泌体可以向体外培养肝脏细胞传递内源性信号,从而对肝脂代谢产生影响,但作用机制还不是很明确,仍待进一步探索研究。而使这些细胞发挥相应效应的有效机制之一是循环外泌体在细胞间的信息传递,以此种方式统筹调动多种细胞功能,才使得内环境稳态维持正常水平。因此,研究循环外泌体在细胞间信息传递的分子机制,对于全面了解、掌握各种肝脏疾病的发生发展机制,以及寻找合适的治疗靶点具有重要意义。本文就奶牛肝细胞源外泌体在奶牛肝脂毒性发生中的作用进行了综述。

1 高NEFA血症引发的肝脏病理变化

NEFA能表现出极强的细胞毒性,对细胞的生物膜结构进行破坏,使得细胞和细胞器受损;它还能增强某些细胞因子毒性,从而在许多疾病的病理变化中发挥重要作用。肝细胞受到高NEFA作用可致使肝细胞细胞器线粒体、内质网膨胀和膜结构通透性增加,进而导致肝细胞出现病理性变化,如变性、坏死和炎性浸润。肝脂毒性的加剧与肝脂代谢紊乱密切相关。当能量负平衡时,机体会进行脂肪动员,但产生过多的NEFA,从而使血中NEFA含量增加;当肝脏摄取过多的NEFA,超出肝细胞内质网对NEFA的氧化能力,促使其合成甘油三脂(triglyceride,TAG)增加,并且转运载体转运能力不足,导致TAG在肝脏中蓄积,产生肝脂毒性效应。

1.1 高NEFA血症可引起肝脏ERS高浓度NEFA是诱发机体ERS的重要原因。ERS是细胞为应对内质网未折叠蛋白或错误折叠蛋白过度沉积做出的生理和病理反应。已有研究表明,肥胖情况下,未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)引起的肝脏生物化学变化和围产期奶牛出现脂肪肝和酮病时的变化相似,因此ERS及其伴随的UPR可能参与了奶牛酮病的形成[6]。酮病情况下的高NEFA血症会进一步导致奶牛肝脏发生代谢性应激,ERS在其中起着关键作用。血液NEFA水平升高,超出肝脏β-氧化的能力后,NEFA就会转化为TAG贮存在肝脏组织中。牛、羊等反刍动物载脂蛋白B(apolipoprotein B,ApoB)的合成能力较非反刍动物低,极低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein,VLDL)的合成转化和分泌也不如后者,在肝脏中出现TAG过度积累,加剧脂代谢紊乱情况下的脂毒性,直接影响内质网稳态,从而引起ERS[7]。越来越多的研究结果表明,泌乳早期高NEFA血症奶牛肝脏发生ERS,过量的脂肪酸蓄积导致肝细胞的ERS[6,8]。虽然众多的因素可引起ERS,但可以明确的是NEFA是泌乳早期奶牛肝脏发生ERS最有可能同时也是最重要的潜在因素。随后的体外试验也证实,犊牛肝细胞原代培养中ERS传感器相关因子和相关酶的激活对NEFA剂量表现依赖性,进一步表明脂肪酸可诱导奶牛肝脏ERS[9]。通过添加高脂饮食的方法,也可以诱导肝脏ERS,并且ERS的发生早于脂沉积,说明ERS参与肝脂毒性的形成[10]。

1.2 高NEFA血症可引起肝脏脂质凋亡肝细胞脂质凋亡是肝脂毒性的另一病理学特征。众所周知,ERS可以诱导细胞死亡和凋亡,ERS诱导的损伤过度而体内平衡不能恢复后,UPR可以通过诱导凋亡而导致细胞死亡[11]。高NEFA引起的脂质蓄积会引起细胞功能紊乱和细胞死亡(脂质凋亡)。最近的研究表明,酮病奶牛存在一定程度的肝脏凋亡,而且NEFA可以引起体外培养的奶牛肝细胞发生脂质凋亡现象[12-13]。亦有报道称,ERS介导脂毒性诱导的肾近端细胞和β细胞凋亡[14-15]。由此可见,高浓度的NEFA可以引起肝脏或肝细胞发生ERS和脂质凋亡,ERS也可导致细胞凋亡。

2 外泌体参与高NEFA血症引起的肝脏病理变化

外泌体作为重要的媒介在细胞间发挥着相互作用,外泌体生物发生是蛋白质质量控制的一种机制,一经释放,外泌体就可以发挥各种各样的作用,如重塑细胞外基质,在各种生理情况与病理状态下发挥不可忽略的作用,其内含的蛋白质、核酸和脂质,可作为细胞间信息传递的载体而表现生物学功能,并且在肝脏疾病的病理进程可以检测出相关表达[16-17]。由此可见,外泌体参与慢性肝病的发生和发展过程。但是,尚未有报道将高NEFA血症环境下外泌体与肝脏脂毒性损伤联系在一起,进而研究高NEFA血症环境下外泌体对奶牛肝脂毒性的加剧作用。关于外泌体是否能生长与分裂,以及在适当的环境下,参与信号传导的方式及靶向范围和自主调节的生化反应过程,仍有待确定。目前尚不清楚外泌体在未经干预的生理水平是否在体内发挥调节内环境稳态或病理过程发生的功能,该研究迫切需要建立可靠的动物模型来探究揭示外泌体的生物来源及发生、运输与识别和细胞靶向与融合。

2.1 外泌体与外泌体miRNA研究进展目前,奶牛外泌体的研究报道主要集中在奶牛血浆、肾细胞、乳汁和脂肪组织,并且以外泌体作为标志物,分析其对奶牛机体代谢状态和药物转运的影响[3-4,18]。但是外泌体存在于机体任意组织器官和体液中,比如实质性器官肝脏、膀胱液亦或是腺体组织中都可以分离得到外泌体(图1)。外泌体是粒径为40～160 nm(平均在100 nm左右)的细胞外囊泡,通过在质膜和内涵体膜上出膜外排,可通过高阶寡聚蛋白复合物的膜结合方式融合,富含核酸、脂质和蛋白质,通过对来源组织细胞或其他靶细胞和组织进行调控,表现生物学效应[16,19]。外泌体miRNAs是没有编码功能的小片段RNA,只能通过与靶mRNA结合并扰乱其翻译过程来影响目标基因表达相应蛋白。因此,近年来人们对外泌体尤其是miRNAs的作用产生了极大的研究兴趣。目前,外泌体的研究主要集中在认识其在细胞间通讯、内脏器官稳态以及疾病的发生发展机制、诊断与治疗方面。外泌体介导的细胞间通讯可以影响肿瘤生长、细胞迁移、抗病毒感染和肝细胞再生,表明外泌体作为诊断或治疗工具具有巨大的潜力[20]。

2.2 外泌体miRNA参与高NEFA血症引起的肝脂毒性高NEFA血症和外泌体的变化密切相关。不论是肝脏的上皮细胞(亦即肝细胞和胆管上皮细胞),还是自然杀伤性T细胞(the natural killer T cells,NKT)、肝星状细胞、成人干细胞及肝窦内皮细胞,均能释放外泌体或被称为外泌体的靶细胞[21]。而且POVERO等[22]通过对比非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver,NAFLD)模型小鼠与对照小鼠的循环血液及肝脏中外泌体水平,发现两者之间具有显著差异,并证明NAFLD动物模型中肝脏是外泌体的主要来源器官。脂毒性导致肝细胞机能受损时,肝细胞源外泌体释放增加,并且肝脏的巨噬系统被广泛激活[23]。以上研究均表明外泌体能密切参与到肝脂代谢过程。脂肪细胞衍生外泌体抵抗素呈递率的降低可以降低肝脏脂肪变性,而对乙酰氨基酚引起小鼠肝损伤的肝细胞源外泌体会加剧受体肝细胞的脂毒性[24-25]。可见外泌体在肝脏脂毒性发生发展过程中起到细胞间通讯因子的作用。当缺血再灌注引起的肝脏损伤用正常肝细胞源外泌体处理后可以得到修复和再生,说明对于一定程度上受损的受体细胞,外源性的外泌体可以对损伤进行修复[23]。

另一方面,因微生物、对乙酰氨基酚和酒精等外源性因素和或其他内源性因素对肝脏细胞造成的损伤,这种损伤情况下肝组织源外泌体对自身肝组织细胞或者其他受体肝细胞都能造成一定程度的异常,进一步说明病理状态下的肝组织源外泌体,能对受体细胞产生不良影响;如果是处理已经遭到损伤的受体细胞会发现原本的损伤被加重[26-27]。在高脂肪高蛋白饲喂条件下,小鼠静脉血中提取分离得到的外泌体注射到对照组小鼠体内,可引起未分化完全骨髓细胞沉积在肝脏中,同时出现全身性炎症反应,导致如脂肪肝疾病、糖尿病和冠状沟脂肪推积等肥胖相关的代谢紊乱[28]。在体外试验条件下,健康成人肝脏干细胞源外泌体能减缓肝细胞癌的扩增和转移,也能促使细胞增殖和抗凋亡,当作用于70%肝切除模型鼠时,其肝脏形态结构和功能作用得以快速恢复[29]。原代肝细胞和Huh7细胞(分化肝细胞癌细胞系)在高浓度脂质试验条件下提取得到的外泌体对巨噬细胞炎性反应有激活作用,进而诱导产生非酒精性脂肪肝炎(NASH)。这些研究证实在病理状态下的细胞所分泌的外泌体会含具有特殊作用蛋白和miRNA,并且分泌量会显著提高,这种情况可能是很多病理变化的始作俑者。外泌体对体内微环境的调控不仅能使癌细胞得以增殖或扩散,还能促使细胞重建联系和恢复活性以平衡体内稳态。间充质干细胞合成分泌释放的外泌体对肝细胞活性的提高有积极影响,并能促进肝细胞分裂增殖[30]。因此,外泌体参与肝脏疾病和损伤的过程,可作为其诊断与治疗的潜在手段之一。酒精性脂肪肝疾病发生过程中,循环外泌体的数量增加,肝细胞释放的外泌体转导miRNA信号进入单个肝细胞,引起单个肝细胞的外泌体释放增多[31]。

以上结果说明,外泌体在NAFLD和NASH中起着重要作用。高NEFA、高β-羟丁酸(BHB)奶牛和人类或者其他动物的NAFLD和NASH同样表现出肝炎和脂肪酸蓄积的病理变化[32]。由此可见,外泌体同样能参与高NEFA血症奶牛的肝脏脂代谢紊乱及其相关的过程。有研究表明,围产期奶牛血浆外泌体对奶牛肾细胞、子宫肌层外膜上皮和基质细胞具有一定的修复作用[33],但是,未见高NEFA血症下的外泌体对受体细胞和组织毒性损伤的系统性报道。由此可见,外泌体参与维持机体内的稳态,在疾病发生发展过程中起着关键作用。

2.3 肝细胞源外泌体miRNA能够通过ERS介导的脂质凋亡通路加剧高NEFA血症引起的肝脂毒性外泌体、ERS和脂质凋亡均参与了肝脏脂毒性损伤,但是其参与的具体机制尚未阐明(图2)。研究结果发现对乙酰氨基酚急性肝损伤来源外泌体能引起受体肝细胞死亡或发生毒性反应,同时上调受体细胞凋亡相关蛋白p-JNK/JNK、Bax和cleaved caspase-3的表达,表明外泌体通过凋亡途径参与肝细胞的病理性损伤[25]。有研究表明,在体外细胞试验中,棕榈酸(脂毒性信号)处理肝细胞,可增加培养基中释放的外泌体,说明外泌体参与了脂毒性的发生和发展过程[34-35]。NEFA引起的脂毒性,不仅可以引起氧化应激,还可以作为ERS的诱导因子[36-37]。同时有研究表明,高浓度的游离脂肪酸(FA)可以引起肝细胞的ERS,进而引起肝细胞的凋亡[38]。ERS主要与UPR密切相关,正常情况下,与ERS关联的葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)同内质网中UPR的相关蛋白分子PERK、IRE1α和ATF6处于紧密结合状态;当细胞受到刺激发生ERS后,UPR的主要介质从ERS的GRP78上解离,从而使PERK、IRE1α和ATF6活化,对下游靶基因GRP78、剪切型的X盒结合蛋白1和活性转录因子4进行调控[6,39]。有研究通过调节营养摄入引起鼠类肝脂毒性发生,结果表明UPR标志物cAMP反应元件结合转录因子p-eIF-2α和p-PERK表达量被上调,进一步证实ERS参与肝脂毒性的发生[40]。ERS本身是一把“双刃剑”,长期或者过度的ERS会触发凋亡,主要是活化CHOP和Caspase-12凋亡蛋白[41]。因此,内质网的稳态变化可能和凋亡的发生有直接的关联。由此可见,外泌体可通过影响ERS和凋亡参与肝脂毒性的发生,而高NEFA通过影响ERS介导的脂质凋亡加剧肝脂毒性。综上所述,外泌体通过ERS介导的脂质凋亡可能是高NEFA血症加剧肝脂毒性的主要原因。

3 小结

酮病的主要病理学特征之一是高NEFA血症,高NEFA血症可通过诱导ERS和脂质凋亡,从而加剧其自身引起的肝脂毒性。在ERS和肝脂毒性的病理发生过程中酮病肝脏源外泌体发挥着重要作用。在不同作用条件下,大多数的组织细胞通过于组织间或外周循环系统中释放含有外泌体的调节物质,对机体的变化起着远程调控的作用。高脂饮食条件下肝细胞源外泌体能加剧因肝脂毒和脂质沉积异常,外泌体的miRNAs在细胞间传递着信号,影响着受体对象脂质合成氧化转运相关基因的表达和蛋白翻译,这些为阐明ERS-脂质凋亡通路提供理论依据。随着目前研究手段得到相应科技水平的支持,外泌体的研究已经在很多领域开展,从其作为一种信号传导分子及在很多疾病的早期诊断起重要作用,以及作为治疗药物的转载工具等方面对其进行了深入研究。当然肝细胞源外泌体miRNAs在肝脂毒性的发生发展过程中起到的具体机制还不是很清楚,相信在研究ERS-脂质凋亡信号通路在肝脂毒性加剧中起到的作用机制后能完善肝脂毒性发生的现象和为此继发病理现象的原发疾病寻找治疗靶点提供理论支持,如奶牛酮病。