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两种中药制剂对大鼠骨质疏松模型的影响

2023-10-25陶琳王克强王玫梁军刘振兴

中国矫形外科杂志 2023年20期
关键词:补益成骨细胞骨密度

陶琳,王克强,王玫,梁军,刘振兴

(1.济南市第二妇幼保健院1a:药剂科,1b:器械科,山东济南 271199;2.山东第一医科大学附属人民医院2a:药剂科,2b:创伤骨科,山东济南 271199)

骨质疏松症是最常见的骨系统疾病之一,与骨折风险增加有关,并给患者带来许多并发症。随着年龄的增长,这种疾病的患病率越来越高,已成为老年人的严重问题[1]。目前针对骨质疏松的治疗药物主要为双膦酸盐类药物、雌激素、维生素D 及钙剂等,以抑制破骨细胞活性,减少骨破坏,并促进骨形成[2]。但其副作用也随之突显,特别是双膦酸盐类药物引起的骨痛、颌骨坏死、肾损害等[3]。中医药正逐步成为治疗骨质疏松症的主要方向[4]。

补肾益精是中医学中防治骨质疏松症的一个重要原则[5],右归丸出自明代张景岳《景岳全书》新方八阵方,近年来在骨质疏松的防治方面获得深入研究[6,7],可改善骨代谢及临床症状,通过调节TGFβ 及AMPK/mTOR 等转导通路,改善骨密度及骨代谢情况[8,9]。但右归丸为温补肾阳之方,性偏燥热。本院在右归丸的基础上,结合现代人脾虚湿盛的体质体征,添加参苓白术散中党参、白术、薏苡仁等健脾利湿,炙龟板、紫河车、阿胶等益精填髓,取得良好临床疗效。本研究通过摘除卵巢大鼠建立骨质疏松症模型,探究补肾健脾、益精填髓方抗骨疏治疗对大鼠骨代谢指标、骨密度及生物力学参数的影响,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

48 只清洁级Wistar 大鼠,雌性,体重(200±50)g,4~5 个月龄,未曾交配。购自江苏省试验动物研究中心,许可证号SCXK(苏)2016-00012。按照随机分组方法,48 只大鼠分为假手术组、模型组、补益组和右归组,每组12 只。

1.2 药物制备

补肾健脾益精填髓灌味剂(补益):按大鼠每百克体重1 g 药量计算。熟地0.252 g、山药0.126 g、菟丝子0.126 g、山茱萸0.090 g、枸杞0.090 g、杜仲0.126 g、当归0.090 g、肉桂0.126 g、制附子0.126 g、紫河车0.126 g、阿胶0.126 g、党参0.200 g、白术0.126 g、薏苡仁0.126 g、砂仁0.090 g(上述药物均为颗粒剂,购于山东第一医科大学附属人民医院药房);炙龟板0.128 g、鹿角胶0.126 g(山东第一医科大学附属人民医院药房)打碎、烊化,混合上述颗粒剂,加20 ml 水既得。

右归丸灌味剂(右归):按大鼠每百克体重1 g药量计算。熟地0.252 g、山药0.126 g、菟丝子0.126 g、山茱萸0.090 g、枸杞0.090 g、杜仲0.126 g、当归0.090 g、肉桂0.126 g、制附子0.126 g(上述药物均为颗粒剂,购于山东第一医科大学附属人民医院药房);鹿角胶0.126 g(山东第一医科大学附属人民医院药房)打碎、烊化,混合上述颗粒剂,加20 ml 水既得。

1.3 手术处理

腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,消毒无菌下在腹部双侧切开皮肤,假手术组动物不切除两侧卵巢,仅将卵巢周围的脂肪切除;其他动物切除双侧卵巢。

1.4 药物干预

术后2 周所有动物每日上午灌胃1 次,连续灌胃12 周。补益组和右归组按每只大鼠每日用药量为成人用药量的6.3 倍计算,大鼠胃容量为0.875 ml/100 g。假手术组、模型组以等量的0.9% 氯化钠溶液灌胃。

1.5 检测指标

1.5.1 尿液标志物检测

最后1 次灌胃干预后,每只大鼠单独关入收集笼内,收集前24 h 尿液。检测尿钙(Ca)、尿磷(P)浓度,并用尿Cr 校正尿液浓缩或稀释对结果的影响。

1.5.2 血液标志物检测

连续灌胃12 周后,静脉麻醉状态下剖腹,抽取主动脉取血,3 000 r/min 离心15 min,取上清血浆,-20℃保存。全自动生化分析仪检测血清中碱性磷酸酶、钙、磷、Ⅰ型前胶原氨基末端肽(PINP)、BMP-2 蛋白[10,11]。

1.5.3 骨密度检测

连续灌胃12 周后,1% 戊巴比妥钠麻醉,剥离股骨,PBS 溶液进行清洗,放入无菌EP 管中,做好标记冷藏保存。在室温下平衡5 min,双能线骨密度测定仪对股骨上端和全部股骨骨密度进行测定。

1.5.4 生物力学检测

采用小动物骨骼强度测定仪(济南益延科技发展有限公司)对股骨样本进行三点测试,将两侧支架间距调整为2.5 cm,固定股骨两端,进行扭转刚度实验。同样固定股骨后用载荷机头对骨干中间以2 mm/min 的速度进行三点弯曲试验,并自动记录计算出最大位移、强度、刚度等[12]。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析,计量资料以±s表示,资料呈正态分布时,采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法;资料呈非正态分布时,采用秩和检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 动物一般情况

手术组大鼠切口愈合良好,未出现出血、感染。所有大鼠实验期间饮食、饮水正常,无死亡大鼠。模型组大鼠毛发干枯、怠惰思卧、身体蜷曲、肢冷。补益组及右归组大鼠毛法光亮、精神佳。实验前各组间体重差异无统计学意义(P>0.05)。处死时,各组大鼠体重均显著大于实验前(P<0.05),其中假手术组、模型组、右归组均显著低于补益组(P<0.05)。见表1。

表1 四组动物体重(g,±s,n=12)与比较Table 1 Comparison of animal body weight among four groups(g,±s,n=12)

指标实验前处死时P 值假手术组258.3±16.8 364.6±14.5<0.001模型组257.4±15.7 365.6±15.4<0.001补益组258.8±11.9 415.7±15.3<0.001右归组256.1±15.7 379.3±14.2<0.001 P 值0.992<0.001

2.2 尿液标志物检测

尿液检测结果见表2,模型组尿Ca/Cr、尿P/Cr显著高于假手术组(P<0.05)。右归组Ca/Cr、P/Cr 与假手术组的差异无统计学意义(P>0.05)。补益组Ca/Cr、P/Cr 显著低于右归组和假手术组(P<0.05)。

表2 四组动物检测结果(±s,n=12)与比较Table 2 Comparison of urine and blood assay consequences among four groups(±s,n=12)

表2 四组动物检测结果(±s,n=12)与比较Table 2 Comparison of urine and blood assay consequences among four groups(±s,n=12)

指标尿液检测Ca/Cr P/Cr血液检测s-Ca(mmol/L)s-P(mmol/L)ALP(U/L)PINP(pg/ml)BMP-2(pg/ml)假手术组模型组补益组右归组P 值0.4±0.1 0.5±0.1 0.6±0.3 0.7±0.2 0.3±0.1 0.3±0.2 0.5±0.2 0.6±0.3 0.043<0.001 2.4±0.1 76.4±6.1 128.6±10.4 238.9±18.6 15.8±0.2 2.4±0.2 76.4±5.2 193.4±9.2 186.5±20.3 10.5±0.1 2.4±0.3 76.2±6.5 110.4±9.8 235.9±18.6 15.7±0.3 2.3±0.2 77.4±5.6 128.9±8.5 207.6±21.1 13.2±0.4 0.577 0.931<0.001<0.001<0.001

2.3 血液标志物检测

血液检测结果见表2,各组大鼠血Ca、P 浓度比较,差异无统计学意义(P>0.05),模型组ALP 水平显著高于其他组(P<0.05)。右归组、假手术组的ALP 水平差异无统计学意义(P>0.05)。但补益组的ALP 水平显著低于其他组(P<0.05)。

除假手术组,其他组PINP、BMP-2 均有不同程度下降。模型组PINP、BMP-2 显著低于其他各组(P<0.05)。补益组PINP、BMP-2 浓度显著高于右归组(P<0.05),而与假手术组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 骨密度与生物力学检测

骨密度与生物力学检测检测结果见表3。模型组的骨密度、最大载荷、最大位移及刚度显著低于其他组(P<0.05)。补益组骨密度、最大载荷、最大位移显著高于模型组、右归组(P<0.05),而与假手术组差异无统计学意义(P>0.05)。假手术组、右归组、补益组的刚度差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 四组动物骨密度与生物力学检测结果(±s,n=12)与比较Table 3 Comparison of results of bone mineral density and biomechanincal test among four groups (±s,n=12)

表3 四组动物骨密度与生物力学检测结果(±s,n=12)与比较Table 3 Comparison of results of bone mineral density and biomechanincal test among four groups (±s,n=12)

指标骨密度(g/cm2)最大载荷(N)最大位移(mm)刚度(N/m)假手术组18.1±2.9 85.2±5.1 0.7±0.1 199.5±4.9模型组12.3±3.3 73.6±6.1 0.5±0.3 154.3±3.5补益组17.9±4.2 84.9±5.4 0.8±0.2 196.8±2.6右归组15.1±3.2 75.3±6.1 0.6±0.1 195.6±4.2 P 值<0.001<0.001 0.003<0.001

3 讨 论

骨质疏松症属中医学“骨痿”、“骨枯”的范畴。在中医理论中肾虚是骨质疏松发生的根本原因。《素问·痿论》“肾主身之骨髓……骨枯而髓减,发为骨痿”,“肾者水脏也,今水不胜火,则骨枯而髓虚,故足不任身,发为骨痿”,故大部分中药治疗骨质疏松集中于补肾壮骨方剂,如李智奎等[13]应用补肾活血方治疗绝经后骨质疏松,结果表明可降低CRP、TNF-α 及IL-6、10 的表达,同时抑制ALP、骨钙蛋白、N 端骨钙素,提高N 端骨钙素水平,改善骨代谢平衡。现代研究也发现一些补肾壮骨中药不仅能够抑制破骨细胞活性,而且部分药物中存在植物类雌激素——黄酮类化合物,发挥雌二醇作用。如淫羊藿[14]、芹菜素[15]、骨碎补等[16]。但近年来研究发现,肠道微生态与骨代谢存在显著相关性[17],肠道菌群的代谢产物——短链脂肪酸(SCFAs)通过降低肠腔内的pH 值,增加钙在大鼠结肠段的吸收[18]。该研究印证了中医理论中关于“脾主运化”论述,“脾为后天之本”,主四肢肌肉。若脾胃亏虚,水谷精微化生不足,肌肉得不到水谷精微的充养,而肾失所藏,肾精不足,筋骨失养,则骨骼与肌肉协调性下降而骨痿不用[19]。本研究中右归丸为基础方药,补肾壮骨,结合参苓白术散方义中的党参、白术、薏苡仁等健脾,发挥调整肠道微生物环境的作用,最后添加大补精血的炙龟板、紫河车、阿胶等益精填髓,该方是中西医理论结合的基础组方,以脾肾两脏亏虚为切入点,取得良好临床效果。

研究结果显示,实验结束时,虽然各组大鼠血Ca、P 差异无统计学意义(P>0.05),但补益组Ca/Cr、P/Cr 显著低于其他组(P<0.05),而右归组Ca/Cr、P/Cr 与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。这可能与补益组中添加健脾中药对肠道菌群的调节有关[20]。进一步研究显示补益组大鼠PINP、BMP-2 水平显著高于模型组、右归组(P<0.05),而与假手术组无显著差异无统计学意义(P>0.05)。BMP-2 是参与调控骨形成过程中的重要途径之一,其中BMP-2 诱导成骨活性最强,是经典BMPs/Smad通路的重要配体,不仅能诱导未分化的骨间质细胞经过趋化期、分化期、骨质形成及重塑期4 个环节,而且在异位骨/软骨形成过程中促进软骨内骨化[21]。叶大林等[22]将小鼠的BMP-2 基因敲除,发现其成骨细胞的功能以及骨骼发育均存在缺陷。本研究中补益组大鼠的BMP-2 水平显著升高,提示补肾健脾、益精填髓法能够显著促进BMP-2 蛋白的分泌,从而调控骨细胞的增殖和分化,促进骨的正常和修复。PINP 是原胶原聚合形成I 型胶原过程中,去除下来的羧基端附加肽段,反映成骨细胞合成骨胶原的能力,为监测成骨细胞活力和骨形成的重要指标[23]。补益组PINP、BMP-2 水平的增加,可能是由于有效的中药成分作为一种良性的刺激,使BMP-2 与细胞膜上的受体BMPRⅠ、Ⅱ结合成复合物,被自身磷酸化所激活后,将信息传递到细胞核,通过对相关物质加以转录促进骨髓基质细胞分化成成骨细胞,增强了成骨细胞活性[24]。

对各组大鼠骨密度和生物力学指标分析结果显示,模型组的骨密度、最大载荷、最大位移及刚度显著低于其他组别(P<0.05),而补益组的骨密度、最大载荷、最大位移显著高于右归组(P<0.05),与假手术组无显著差异。这反映了补益组在改善骨代谢、防止矿物质丢失方面的作用效果。柴爽等[25]研究补肾、健脾、活血方剂干预骨质疏松症大鼠模型,亦发现其在改善大鼠骨密度方面能够取得满意的效果。

综上所述,补肾健脾、益精填髓法具有对抗骨质疏松的效果,且作用机制可能与其调整肠道微生态环境,减少骨矿物质丢失,上调骨组织中BMP-2 表达,增加成骨细胞活性有关。

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