疑似猪繁殖与呼吸综合征案例浅析

孙自力

（砀山县畜牧兽医水产服务中心，安徽宿州 235300）

近年来，我国畜牧业快速发展，宿州市畜牧业的发展都呈现出良好的态势，特别是生猪养殖产业发展受到广大养殖户的追捧[1-3]。猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratorysyndrome，PRRS）是高度接触性传染病，极易流行，并只在猪中进行传播[4-6]，大白、长白、杜洛克、大约克等品种的不同年龄段的公猪、母猪均可被感染，但妊娠母猪和1 月龄以内的仔猪最容易感染[7-9]。不同年龄段、不同性别生猪感染上该病后症状不同，一般母猪感染后容易导致早产、流产、死胎、弱仔；公猪感染后精液品质下降，初生猪仔感染后死亡率升高，其他年龄猪则带来不同的呼吸系统疾病[10-12]。

PRRSV是一类RNA病毒[13-14]，一般临床诊断主要是通过病猪典型临床症状、特征性组织学病理变化（尤其是间质性肺炎）及病原学鉴定做出诊断[15-16]。如果生猪出现以下几种临床症状可以首先考虑感染高致病PRRSV 病毒：①患眼结膜炎、眼睑部分水肿；体温升高，达40 ℃左右；出现咳嗽、气喘等呼吸道症状，同时若观察到患病猪蓝耳尖，蹄端、外阴部、乳头发绀，则临床诊断可以成立[17-18]。②解剖后显微镜下观察脾脏，边缘出血性梗死，肾脏呈土黄色，表面有肉眼可见针尖至米粒大小的出血点，包括皮下、扁桃体、心脏、膀胱等均有出血点或出血斑，则病理学诊断成立[1]。③病原学鉴定则使用PRRSV实时荧光PT-PCR检测，若检测结果为阳性，则可确认为该传染病[19-20]。本研究针对实际工作中接触到的一例疑似PRRSV 病毒感染案例，对其进行诊断、检测，并提出意见，希望可以为生猪产业发展、PRRSV疫病防控提供借鉴。

1 案例来源

养猪场养猪92 只，其中能繁母猪26 只，饲养方式为圈舍饲养，3月初养殖场负责人张某发现其中一只妊娠母猪精神不振、食欲减退，呼吸出现轻微困难，向县畜牧中心专家进行咨询。

到达现场后发现，该妊娠母猪未流产，但有精神倦怠、厌食、低热等症状，检查后发现耳未发紫，不排除考虑是否为感染猪繁殖与呼吸综合征病毒。

2 诊断

2.1 采样

一般采样有3种方法：①组织研磨液，每份组织分别从3个不同部位称取约1 g样品，用手术剪刀剪碎后取出约0.05 g 于研钵中研磨，加入1.5 mL 无菌生理盐水继续研磨，液浆均匀后转移至离心管离心，取上清液；②拭子，采集拭子样品，放入1 mL无菌生理盐水中，涡旋震荡后直接使用；③血清，采集血液放入离心管，加入EDTA抗凝血试剂，离心机离心后吸取上层血清[2]。

本次检测主要采集该妊娠母猪及共同生活其他母猪血液放入离心管，加入EDTA抗凝血试剂，离心机离心后吸取上层血清。

2.2 RNA核酸提取

硅基质膜可提取纯化的病原RNA 用作病原核酸扩增检测模板。

2.2.1材料试剂裂解液、洗液、洗脱液、吸附柱和收集管。

2.2.2提取步骤①使用移液枪取100 μL 样品加入裂解液600 μL，之后颠倒直至样品与裂解液完全混匀，室温静置3～5 min，是为了使样品中的RNA充分裂解出，方便后续对RNA 提取操作。②使用移液枪将液体吸出液体，此操作要注意尽量不要吸到悬浮在液体中的杂质，防止在离心时堵塞，然后将吸出液体吹至套上收集管的吸附柱中，将吸附柱放一一对称放至离心机中，离心机转速设置为13 000 r/min，离心时间设置为30 s。③从离心管中取出套着收集管的吸附柱，扔掉收集管中收集的液体，之后加入洗液，体积为600 μL，在一一对应放入离心机中，设置转速13 000 r/min，时间30 s，并且将该步骤重复操作2 次，确保洗液彻底。④从离心管中取出套着收集管的吸附柱，扔掉收集管中液体，再放入离心机中，设置转速13 000 r/min，时间2 min，此时是空柱离心目的是除去残留洗涤液。⑤从离心管中取出吸附柱，将其放至新的刻度为1.5 mL 的离心管中，向吸附柱中央加入洗脱液50 μL，室温静置1 min 后，放入离心机，设置转速13 000 r/min，离心时间30 s，此时目标RNA在洗脱液下经过离心，全部流至离心管中，之后取出离心管，管中所剩下液体即为所需模板RNA。

2.3 猪繁殖与呼吸综合征实时荧光PT-PCR检测

提取样品RNA 在高效转录酶作用下以RNA 为模板，以引物为起点合成与RNA 模板相互补的cDNA链，在热启动Taq酶的作用下，经高温变性、中温退火及延伸的循环，使特异DNA片段的拷贝数放大1倍，经荧光素标记的探针与扩增的DNA杂交，利用Taq聚合酶使荧光探针的报告基团与淬灭基团分离，发出特异性荧光信号，根据样品Ct 值的大小及扩增曲线的形成情况判定结果[3]。

2.3.1材料试剂阴性对照组、阳性对照组、无菌无核酸酶水、RT—PCR反应液、酶混合液、荧光探针

2.3.2操作步骤配制反应体系试剂，体系组成部分如表1所示。

表1 反应体系组成部分单位：μL

其中N是指被检测样品、阴性对照组、阳性对照组总和。该检测共设被检样品两组（疑似猪繁殖与呼吸综合征妊娠母猪与一起生活的正常母猪RNA提取模板），N 为4。因此无菌无核酸酶水用量25 μL，PT-PCR 反应液用量62.5 μL，酶混合液用量5 μL，荧光探测针用量22.5 μL。

将以上配制反应体系充分混匀，之后在每个反应管中各加入23 μL，然后再分别在每个反应管中加入2 μL 模板RNA，充分混匀并做好标记，在荧光PCR 上进行反应，读取最终Ct 值。PCR 反应条件见表2。

表2 PCR反应条件

2.4 鉴别诊断

2.4.1与猪瘟区别最常见急性猪瘟，在感染初期，精神沉郁，食欲降低，体温升高至41～42 ℃，稽留高热，眼部分泌物（黏性、脓性）增多，伴发结膜炎导致好流泪，怕冷、嗜睡、厌食、口渴、喜饮水，便秘或持续腹泻，大便呈糊状，灰色、黄白或淡黄色。全身颤抖、被毛蓬乱、毛孔显现、步态不稳等症状。后期表现呼吸困难、消瘦、打堆。耳尖、乳头、会阴、四肢末端皮肤发绀，坏死，有些病猪双耳尖及尾部出血，坏死，有红色变为蓝黑色，易被其他猪撕咬[4]。病猪死亡快，一般在感染后10～20 d内死亡。病程长者，眼睛有大量分泌物，眼睑常黏连，抗生素治疗无效。感染PRRSV 病毒初期临床症状和病理变化与猪瘟相似，临床上极易发生误诊。因此，应综合临床症状、剖检变化、实验室诊断来确诊[5]。

2.4.2与猪链球菌病区别猪链球菌病发病急、传播快，体温升高41～43 ℃，精神沉郁、嗜睡、食欲降低，眼结膜发红、眼内分泌物增多、呼吸加快。少数病猪在后期耳尖、四肢末端、背部等充血[6]。该病最主要特点是无先兆症状突然发病，可以通过不同病型，使用青霉素、阿莫西林、氨苄西林等对猪链球菌病敏感的抗菌药物治疗[20]。

2.4.3与猪伪狂犬病区别猪伪狂犬病多是群体发病，要么不发，一发病就会不止一例，大约在25%左右。即便是出现一头有神经症状的，那些还没出现神经症状的也一定有腹泻或呕吐的现象存在。患伪狂犬病的猪表现为精神紧张，精神沉郁，两耳后竖，遇到声音刺激后发生鸣叫，后期刺激则叫声嘶哑。口角有泡沫、晕睡、呕吐、拉稀的症状[21-22]。

3 结果与分析

3.1 临床症状观察

主要观察疑似感染妊娠病猪是否流产、早产、生理状态及共同生活生猪生理状态。该妊娠母猪未流产，但精神倦怠、厌食、低热，检查后发现耳未发紫，也未发现一次性血斑，共同生活其他母猪精神良好、进食正常，不排除考虑是否为感染猪繁殖与呼吸综合征[23]。

3.2 猪繁殖与呼吸综合征实时荧光PT—PCR检测结果

3.2.1试验结果成立判定标准试验结果判定标准见表3。

表3 判定标准

3.2.2试验结果在本次试验中，阳性对照组Ct值≤30 并出现特异性扩增曲线，阴性对照组无Ct 值并且无特异性曲线，说明该实验结果成立[8]。

疑似感染生猪样本与共同生活生猪样本，均未出现特异性曲线，且无Ct值读取。说明检测样品均为阴性，表明该妊娠母猪并未感染PRRSV。

4 在动物疫病防控工作开展情况

为了解到猪繁殖与呼吸综合征病毒流行和感染情况，以便为猪繁殖与呼吸综合征病毒的预防控制提供客观量化指标，13 个乡镇3 个园区随机抽取的6 家规模养殖场，14 家非规模养殖户采集的400 份猪血液样本进行检测。检测结果见表4。由表4 可知，在随机抽取6 个乡镇共采集猪的血液样本400 份。经过PRRSV 病毒实时荧光PT-PCR检测后，PRRSV 阳性数量40 份，阳性率10%。规模养殖场共采集120 份检测样本，均未检测出PRRSV 阳性；非规模化养殖户共采集280 份检测样本，其中40 份检测为PRRSV 阳性，阳性率14.28%。唐寨镇非规模养殖户采集20 份检测样本，未检测出PRRSV 阳性，阳性率为0；周寨镇非规模养殖户采集80 份检测样本，其中检测出PRRSV 阳性样本10 份，阳性率12.5%；玄庙镇非规模养殖户采集80 份检测样本，其中检测PRRSV 阳性样本20 份，阳性率25%；赵屯镇非规模养殖户采集40 检测样本，未检测出PRRSV 阳性，阳性率0；程镇非规模养殖户采集40 份检测样本，其中检测PRRSV 阳性样本10 份，阳性率25%；葛集镇非规模养殖户采集20 检测样本，未检测出PRRSV 阳性，阳性率为0。

表4 猪繁殖与呼吸综合征病毒检测

本次对随机抽取的6 个乡镇400 头猪的血液进行PRRSV 实时荧光PT-PCR 检测，结果表明PRRSV病毒在规模养殖场均得到很好的防控，无一规模养殖场检测出感染病猪，但是在非规模养殖户中阳性率明显高于规模养殖场，其中在周寨镇、玄庙镇、程庄镇非规模养殖户均有感染得病生猪，因此对于非规模养殖户在养殖过程中要特别重视对PRRSV 的预防控制，及时对PRRSV进行鉴别诊断。

畜牧中心持续排查非洲猪瘟、高致病性猪蓝耳病等重大动物疫情，2022 年共排查养殖场点7.2 万场次，排查生猪80.2 万头次，没发现非洲猪瘟、高致病性猪蓝耳病等重大动物疫情；严抓非洲猪瘟等重大动物疫病各项防控措施的落实，非洲猪瘟、高致病性猪蓝耳病等动物疫情排查、生猪及产品调运监管、规模养猪场责任包保制度、生猪定点屠宰企业“两项制度”、病死生猪无害化处理等各项防控措施得到全面落实；多次开展养殖场消毒灭源活动，全年发放消毒药356 件；开展了春秋两季重大动物疫病强制免疫活动，圆满完成了春秋两季集中强制免疫工作，共免疫共防疫注射牲畜口蹄疫疫苗80 万头剂、高致病性禽流感疫苗600 万mL、小反刍兽疫疫苗40 万头剂，流行病学调查和疫病监测养殖场380 余家，自检和上报采样3 200 样份样品全部合格，确保了全县无疫情发生，重大动物疫病强制免疫成效显著。

5 预防措施

猪是PRRSV的唯一宿主，妊娠母猪和一月龄仔猪最容易感染。病毒可以通过粪便、鼻腔分泌物、尿液等进行排出传播，感染其他正常猪，感染一般通过鼻与鼻亲密接触或污染粪污尿液接触，距离越近，越容易感染[9]。该病毒在低温下存活，冬天为高发期。要避免PRRSV的暴发，应做到以下几点。

（1）坚持自繁自养，在从外地引进猪时，务必事先做好检测事宜，确保外来猪为携带猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒，引进的外来猪要进行隔离，时间至少两周，观察状态，确保安全后再放入猪群。定期对母猪、仔猪进行该病的病原学血清检测，及时淘汰可疑病猪。

（2）疫苗免疫是一种有效控制该病暴发的有效手段，定期对猪注射灭活疫苗，特别是后备种母猪，要在配种前进行两次免疫，严格按照我国制定的《高致病性猪蓝耳病防治技术规范》和《猪病免疫推荐方案》落实各项防控措施[10]。

（3）加强猪圈舍内部的消毒工作，对空圈舍及圈舍周围环境用热2%氢氧化钠等溶液进行彻底喷杀，对圈舍及猪本身使用百毒杀、复合酚等消毒剂，3天内定期进行消毒。

6 结语

综上，PRRSV 一旦发展流行起来非常严重，能短时间内引发大量猪的患病和死亡，给养殖业带来巨大的损失。养猪必须要严格地制定一系列防治体系，在养殖期间，要应用科学的饲养管理知识，加强卫生消毒工作，最好坚持自繁自养、全进全出的饲养制度[11]。此外，对新生仔猪或者母猪配种前，要做好疫苗的接种工作降低发病率，提高猪的养殖效益。