用五选择连续反应时间任务模型评价咖啡因和盐酸羟哌吡酮对大鼠注意力、行为控制和反应速度的调节作用

鲍金豪，常海霞，3，黎进峰，房鑫鑫，代 威，李云峰

〔军事科学院军事医学研究院1.军事认知与脑科学研究所，2.毒物药物研究所，北京 100850；3.山东第一医科大学（山东省医学科学院）药学院，山东 泰安 271016〕

注意是认知功能第一步，持续维持高水平的警觉和注意力是信息连续加工和保持良好脑作业能力的前提。同时，注意力与感知、学习、记忆和执行功能有着密切联系。事实上，注意力缺陷经常发生在包括抑郁症、精神分裂症、阿尔茨海默病和注意缺陷多动障碍等神经精神疾病中，因此，提升注意力被认为是治疗这些疾病的重要治疗策略之一［1］。目前，治疗注意缺陷障碍的药物主要包括精神兴奋药（如哌甲酯）、抗抑郁药（如托莫西汀和氟西汀）、单胺氧化酶抑制剂司立吉兰、肾上腺素α2受体激动剂可乐定和一些中药等［2］。

研究表明，咖啡因（caffeine，CAF）是腺苷A1和A2受体的竞争性拮抗剂［3］，一直以来被认为可发挥抗疲劳、促觉醒和增加警觉的作用，但其认知增强特性一直存在争议［4］，并且在是否可提高注意力方面的报道亦存在诸多矛盾［5-7］。本研究拟系统评价CAF对大鼠注意力、行为控制和反应速度的调节作用。

盐酸羟哌吡酮（代号：YL-0919）是毒物药物研究所自主研发的新型抗抑郁小分子化合物，在多种动物模型中表现出抗抑郁和抗焦虑作用，且具有快速起效、增强认知和不导致性功能障碍等潜在优点，目前作为1.1 类抗抑郁新药进入Ⅱ期临床试验［8］。研究发现，YL-0919具有选择性激动Sigma-1受体的作用［9］。文献报道，抗抑郁药具有增强注意力的潜能［10］，本研究室前期通过膜片钳实验发现，单次给予YL-0919 可优先抑制前额叶皮质γ-氨基丁酸中间神经元，增强谷氨酸能锥体神经元兴奋性［11］。同时该药具有促认知样活性，但其对于作为认知第一步的注意是否有影响尚不明确。本研究拟探究YL-0919是否通过提高注意力发挥促认知作用及其在大鼠行为控制和反应速度上的作用。

目前，可用于注意力评价的动物模型较少，其中五选择连续反应时间任务（5-choice serial reaction time task，5-CSRTT）是公认的可用于检测啮齿动物持续性主动注意力的行为检测方法［12］。该实验需训练动物对在5 个位置中随机呈现的1 个位置上的短暂视觉信号做出响应，经药物或其他实验手段干预后，可同时反映药物或者实验操作对动物注意力、行为控制和反应速度等的影响。由于与人类持续注意力评价——连续操作测试（continuous performance test，CPT）相似，且具有自动化程度高和参数灵活等特点，5-CSRTT 在该研究领域得到广泛应用［13］。

本研究运用5-CSRTT 评价不同机制的YL-0919 和CAF 对SD 大鼠注意力、行为控制和反应速度的影响，并比较二者作用特点的异同，旨在为发现新型注意力提升药物及靶标提供新的线索和思路。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性SD 大鼠，SPF 级，体重180～200 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证：SCXK（京）2019-0010。大鼠以每笼4 只群居饲养，限制进食，自由饮水。饲养环境温度20～24 ℃，湿度50%～60%，12 h 黑暗/白昼交替照明（光照时间8∶00～20∶00）。所有动物实验程序均由军事医学研究院实验动物福利伦理委员会批准，伦理审核编号：IACUC-DW2X-2022-605。

1.2 药品、试剂和仪器

YL-0919（批号：D5222-18-001，纯度＞99.9%），浙江华海药业有限公司；CAF（批号：TC130184，纯度＞99.9%），石药集团新诺威制药股份有限公司。颗粒饲料（每粒45 mg，直径0.356 cm），美国Bio-Serv 公司。基本行为测试包-大鼠五孔鼻触实验箱（4 组）及配套软件（型号MED-NP5L-B1），美国Med Associates公司。实验箱（45 cm×25 cm×30 cm）底部为不锈钢横杆，其中一侧壁上装有1 个食盒和1 盏食盒灯；在对面侧壁下方距底部3 cm处有横向等距排列且外观一致的5 个边长3 cm 的正方形鼻触孔，每个鼻触孔中各有1盏信号灯和1个红外探测装置，实验程序运行和数据采集由软件控制完成。

1.3 大鼠5-CSRTT行为训练［12］

大鼠每次训练或测试前禁食16～18 h。大鼠经训练后用于评价药物。整个过程中，每只大鼠在同一实验箱中进行训练和测试。训练和测试过程如图1所示。

Fig.1 Flowchart of 5-choice serial reaction time task（5-CSRTT）testing. After acclimatization，the rats were pre-trained to master the association between light source signals and feed pellet delivery.After the rats were formally trained to master the behavioral test under the conditions of signal duration (SD)=1 s，limited hold (LH)=5 s，and interatrial interval (ITI)=5 s，the rats were tested and grouped at baseline，and then randomly balanced into normal control group and drug administration groups according to their attention levels.During the administration and formal testing phase，the above experimental conditions were maintained. Depending on the group，rats were ig given hypidone hydrochloride（code YL-0919）2.5 and 5.0 mg·kg-1，caffeine（CAF）2.5，5.0，10.0 and 20.0 mg·kg-1 or ddH2O separately 1 h before the formal test. The animals were given drugs several times. Each drug was given in order of concentration，with an interval of several days between each concentration，during which the animals were not administered but kept under training and data were recorded，and when there was no significant difference between the administered group and the model control group，the next concentration of the drug was tested on the following day. Accuracy was measured as percent correct〔correct responses/（correct responses+incorrect responses）×100%〕. Correct responses were recorded as responses made to the right stimulus location during the LH. Incorrect responses were recorded as responses made to the wrong stimulus location during the LH. An omission error was recorded as a failure to respond to the visual stimulus within the LH. Premature responses were recorded as responses made during the ITI period.Perseverant responses were recorded as responses made after a correct response but prior to the collection of food reward. Average latency to make a correct response was recorded as the average time from the onset of the light stimulus until a nosepoke into the correct niche being registered. Average latency of food reward was recorded as the average time from the registration of a correct response to the retrieval of a food reward from the magazine well.

1.3.1 预适应

连续3 d，每天轻柔抓取抚摸大鼠使其适应实验环境和操作，以减少无关应激刺激对后续实验结果的影响。

1.3.2 适应训练

大鼠限制饮食，除训练过程所得颗粒饲料外，每只大鼠每天仅提供约12 g 普通饲料，以保持其训练时处于饥饿状态。每天将大鼠放入实验箱内15 min，每15 s投放1粒颗粒饲料供大鼠食用，共投放50 次，使其熟悉饲料颗粒的投放位置和投放方式，大鼠食用超80%饲料颗粒时进行下一步训练。

1.3.3 预备训练

每天将大鼠放入实验箱内训练15 min。在每轮训练周期中，首先随机持续点亮五孔信号灯中的1 孔，当大鼠鼻触正确信号灯（即点亮的信号灯）并触发红外感应时，信号灯灭，食盒灯亮，并投放一粒饲料至食盒，大鼠吃饲料后食盒灯灭，并启动下一轮训练周期。经过训练，使大鼠对鼻触正确信号灯与得到饲料颗粒建立条件反射。大鼠15 min 内得到并食用达40粒颗粒饲料时进入下一步训练。

1.3.4 正式训练

每天训练50 轮训练周期。首个周期开始前及相邻训练周期启动之间的时间间隔，设为间隔期（interatrial interval，ITI），间隔期大鼠每次鼻触五孔将记录为1 次冲动反应，仪器照明灯熄灭2 s 进行惩罚并重新开始ITI。每轮训练设定限定期（limited hold，LH），限定大鼠鼻触信号灯的时间，包括信号期（signal duration，SD，5孔中随机1孔信号灯亮的持续时间）和后续期2 个阶段。ITI 结束后进入SD，五孔信号灯随机亮1 孔，在LH 期间，若大鼠鼻触亮灯孔，仪器信号灯灭，食盒灯亮，并投放1 粒饲料颗粒至食盒，大鼠吃饲料后食盒灯灭，记为1次正确反应，若投放饲料颗粒至大鼠摄食期间继续鼻触五孔，每次记为1次固执反应，从信号开始到鼻触亮灯孔的时间记为正确潜伏期，从正确反应至动物开始摄食饲料颗粒的时间记为摄食潜伏期，本轮训练周期结束；若大鼠鼻触未亮灯的孔，记为1 次错误反应，若未进行鼻触，记为1 次遗漏反应，出现错误反应或遗漏，仪器不投放饲料，且照明灯熄灭2 s 进行惩罚后本轮训练周期结束。将SD 和LH 的起始时长设定为20 s、ITI 为5 s，在同日的50 轮训练周期中，SD 和LH 时长保持不变，当大鼠准确率〔正确次数（/正确次数+错误次数）×100%〕达到80%，则在次日训练时将SD 和LH 逐步缩短（依次为15，13，12，10，8，7，6和5 s），ITI维持不变。准确率未达标的动物以原条件继续训练3 次，仍不达标的将予以淘汰。在此之后，SD 设定逐步由5 s降至4，3.5，3，2.5，2，1.5 和1 s，LH 和ITI 保持5 s。大鼠在程序参数SD=1 s，LH=5 s，ITI=5 s下的行为测试中连续3 d的准确率无显著差异后进行下一阶段。

1.4 药物干预5-CSRTT大鼠行为试验

1.4.1 基线测试和分组

基线测试前2 d 进行适应性灌胃，每天1 次（双蒸水，0.4 mL·d-1）。基线测试连续3 d，测试程序参数：SD=1 s，LH=5 s，ITI=5 s，每天测试15 min 或50 轮测试周期，记录大鼠操作基线，观察指标为准确率、正确次数、错误次数和遗漏次数。依据准确率将大鼠随机均衡分为模型对照组（双蒸水）和给药（CAF或YL-0919）组，每组16只。

1.4.2 给药和正式测试

测试程序参数：SD=1 s，LH=5 s，ITI=5 s，测试15 min或50轮测试周期。测试前1 h，大鼠依据分组单次ig 给予双蒸水、YL-0919（2.5 和5.0 mg·kg-1）或CAF（2.5，5.0，10.0和20.0 mg·kg-1）。观察指标包括注意力评价指标（准确率、正确次数、错误次数和遗漏次数）；行为控制评价指标（冲动次数和固执次数）；反应速度评价指标（平均正确潜伏期和平均摄食潜伏期）。

训练达标的动物重复给药，各药物按剂量从低到高的顺序给予，2 次给药测试间间隔数日，期间动物保持训练（程序参数同测试程序）并记录上述行为评价指标，当给药组与模型对照组注意力评价指标无显著差异时，于次日进行下一浓度药物的测试。

1.5 统计学分析

实验结果数据用±s表示，采用GraphPad Prism 8.0.1 进行数据分析和绘图，两组间比较采用Studentt检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CAF对5-CSRTT大鼠注意力的影响

如图2 所示，与模型对照组相比，CAF 2.5 和5.0 mg·kg-1组大鼠行为反应的准确率、正确次数、错误次数和遗漏次数均无显著差异，但10.0 和20.0 mg·kg-1组正确次数显著减少（P＜0.05，P＜0.01），准确率亦显著下降（P＜0.05）。由此提示，CAF 10.0和20.0 mg·kg-1可减弱大鼠注意力。

Fig. 2 Effect of CAF on behaviors of attention in 5-CSRTT model rats.See Fig.1 for the rat treatment，experimental parameters and annotate.±s，n=16. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with model control group.

2.2 CAF 对5-CSRTT 大鼠行为控制和反应速度的影响

如图3所示，与模型对照组相比，在行为控制指标中，仅CAF 20.0 mg·kg-1组大鼠冲动次数显著增多（P＜0.01），2.5，5.0 和10.0 mg·kg-1组冲动次数和固执次数均无显著差异；在反应速度指标中，CAF 2.5，5.0，10.0 和20.0 mg·kg-1组平均正确潜伏期和平均摄食潜伏期均无显著差异。由此提示，CAF 20.0 mg·kg-1可减弱行为控制，增强冲动，但不影响反应速度。

Fig.3 Effect of CAF on behavioral control（A and B）and reaction speed（C and D）in 5-CSRTT model rats.See Fig.1 for the rat treatment，experimental parameters and the annotate.±s，n=16.＊＊P＜0.01，compared with model control group.

2.3 YL-0919对5-CSRTT大鼠注意力的影响

如图4 所示，与模型对照组相比，YL-0919 5.0 mg·kg-1组错误次数显著减少（P＜0.05），准确率显著提高（P＜0.05），正确次数和遗漏次数无显著差异；2.5 mg·kg-1组准确率、正确次数、错误次数和遗漏次数均无显著差异。由此提示，单次ig给予YL-0919 5.0 mg·kg-1可通过同时减少错误次数和提高准确率而提高大鼠注意力。

Fig.4 Effect of YL-0919 on behaviors of attention in 5-CSRTT model rats. See Fig.1 for the rat treatment，experimental parameters and annotate.±s，n=16.＊P＜0.05，compared with model control group.

2.4 YL-0919 对5-CSRTT 大鼠行为控制和反应速度的影响

如图5 所示，与模型对照组相比，YL-0919 2.5和5.0 mg·kg-1组大鼠冲动次数、固执次数、平均正确潜伏期和平均摄食潜伏期均无显著差异，提示单次ig 给予YL-0919 2.5 和5.0 mg·kg-1对大鼠行为控制和反应速度无明显影响。

Fig.5 Effect of YL-0919 on behavioral control（A and B）and reaction speed（C and D）in 5-CSRTT model rats.See Fig.1 for the rat treatment，experimental parameters and annotate.±s，n=16.

3 讨论

5-CSRTT 是模拟人类持续注意力评价范式CPT，用以测试啮齿动物注意行为的经典行为范式［12］。5-CSRTT 旨在发现治疗注意力缺陷障碍和阿尔茨海默病等中枢神经系统疾病的药物，也可用于探索注意力和冲动性的神经生物学过程。据报道，基于5-CSRTT已发现尼古丁［14］、安非他明［5］、哌甲酯［5］和托莫西汀［15］等化合物具有提高注意力的作用，表现为提高准确率或减少冲动行为等。

CAF 被认为可能具有提高注意力的作用，但一直存在争议［5-7］。Higgins 等［6］发现，单次ip 给予CAF（1.0～10.0 mg·kg-1）不影响准确率和遗漏次数，而单次ip 给予CAF（10.0 mg·kg-1）显著增加冲动次数，这与本研究中ig 给予CAF（10.0 和20.0 mg·kg-1）减弱注意力，同时增加冲动行为的结果相类似。结合文献和本研究结果，提示CAF 在本研究受试剂量范围内主要表现为增强动物冲动和警觉，而不影响甚至减弱注意力。提示CAF 更多的表现为抗疲劳、提高警觉效应而非注意力增强作用。

YL-0919 是选择性Sigma-1 受体激动剂［9］，在1.25～5.0 mg·kg-1剂量范围内具有抗抑郁活性［16-18］。本研发现，YL-0919 在其抗抑郁剂量范围内可通过减少错误次数和提高准确率显著提高大鼠注意力，同时不影响行为控制和反应速度。提示提升注意力可能YL-0919 发挥抗抑郁、促认知作用的作用特点之一。文献表明，Sigma-1受体激动剂具有增强认知作用［19-20］，因此该受体可能参与了YL-0919 的注意增强作用。

综上，本研究结果表明，CAF 和YL-0919 在5-CSRTT 中具有不同的作用特点，YL-0919 可提高正常SD 大鼠的注意力，表现为减少大鼠在5-CSRTT 中的错误次数，提高准确率，且不影响大鼠的行为控制和反应速度；CAF 可降低大鼠注意力并减弱行为控制能力，表现为减少正确次数，降低准确率并增加冲动次数。未来将针对更多剂量和更多给药方式对二者作用的异同进行进一步研究。