人参皂苷Rg3 对帕金森病模型大鼠多巴胺能神经元氧化应激的抑制作用

侯晓丽，张亚慧，唐迎乐

（1.扬州市职业大学医学院，江苏 扬州 225000；2.扬州大学医学院，江苏 扬州 225000）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）的发病机制非常复杂，目前认为其发病机制可能涉及氧化应激、线粒体功能缺陷、环境及遗传等因素[1]。已有证据表明[2，3]，氧化应激反应和自由基损害在PD 等神经变性疾病中起重要作用。另有研究表明[4]，PD 患者中脑黑质内存在铁离子浓度升高、线粒体功能下降、抗氧化保护系统如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）等功能异常，导致氧化应激反应增强，氧自由基产生过多，引起蛋白质、脂质过氧化损害和断裂，导致神经元发生凋亡。此外，PD 患者黑质区脂质过氧化产物丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）和过氧化脂质的浓度高于正常10 倍之多[5]。上述研究表明氧化应激参与了多巴胺能神经元的损伤。谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）可特异催化GSH 对过氧化氢（H2O2）的还原反应，对细胞结构和功能的完整具有重要的保护作用，GSH-PX 活力的高低直接反映了机体清除自由基的能力[6]。SOD 对机体的氧化与抗氧化平衡起着重要作用，它能清除超氧阴离子和自由基而保护细胞免受损伤，其活力高低间接反映了机体清除氧自由基的能力[7，8]。机体产生的氧自由基能攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，产生脂质过氧化物，如MDA、羟基、羰基等而引起细胞死亡，故MDA 可反映体内脂质过氧化的程度，从而间接反映细胞受自由基攻击的严重程度。人参皂苷-Rg3为祖国传统中药人参中分离提纯的四环三萜类人参二醇型皂苷单体，研究发现[9，10]，20（S）-Rg3 具有良好的抗脑缺血及神经细胞保护作用。据报道[11，12]，Rg3能使SOD 和GSH-PX 生成增加，而使MDA 产生减少，从而对脑缺血损伤具有保护作用。但有关人参皂苷Rg3 对PD 模型大鼠的保护作用及其分子机制研究较少，基于此，本研究以R-NLC 制备PD 大鼠模型，测定黑质区域MDA 浓度及SOD、GSH-PX 活力，检测Rg3 对R-NLC 诱导的黑质多巴胺能神经元氧化应激的影响，初步探讨Rg3 保护黑质多巴胺能神经元的机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 SD 成年雄性大鼠24 只，体重（185±20）g，由扬州大学实验动物中心提供，SPF 级，许可证号：SYXK（苏）2007-0005，自由饮食饮水及活动。SD 大鼠随机分为对照组、模型组、Rg3 组和阳性药物组，每组6 只，分别编号1～6 号。各组大鼠均于造模前3 d 开始给药，1 次/d，连续31 d，Rg3 组给予6 mg/kg Rg3 灌胃，阳性药物组给予11 mg/kg 司来吉兰灌胃，对照组及模型组给予6 mg/kg 羧甲基纤维素钠CMC-Na 灌胃。灌胃3 d 后除对照组外，其余3 组大鼠均皮下注射鱼藤酮纳米脂质载体（R-NLC），首剂量给予0.5 mg/kg，第2 次给予0.8 mg/kg，此后每次1 mg/kg，2 d/次，连续28 d，对照组皮下注射同等剂量空白纳米脂质载体。

1.2 试剂 人参皂苷Rg3（纯度98%）购自吉林大学植化室；盐酸司来吉兰片购自南京思科药业有限公司；羧甲基纤维素钠购自天津光复精细化工研究所；鱼藤酮购自广东省丰顺化工厂；鱼藤酮纳米脂质载体（R-NLC）为自制；丙二醛（MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；冰醋酸、EDTA 等试剂购自北京北化精细化学品有限责任公司。

1.3 仪器设备 使用仪器：普通台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；高速冷冻离心机（5475R，德国Eppendorf 公司）；电子天平（METTLER，AE240，瑞士）；高速均质乳化机（PT-3100，瑞士POLYTRON）；恒温水浴箱（HH-2，国华电器有限公司）；超净工作台（上海洁净设备厂）；磁力搅拌器（中国南汇电讯器材厂）；DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机（宁波新芝科器研究所）；Synergy2 酶标仪（Bio-Tek 公司）；MilliQ plus 超纯水系统（Millipore）；超低温冰箱（-86 ℃，美国Thermo Scientific Revco）。

1.4 大鼠外观行为表现 根据相关文献[13]开展对大鼠的行为表现评分，具体评分方式为：若大鼠出现拒捕行为变弱，大鼠毛色变脏变黄，弓背，主动活动减少行为学评分记为1 分；若大鼠出现动作迟缓，有震颤或有步态不稳行为学评分记为2 分；若大鼠步态不能成一条直线前进，且出现单侧旋转行为学评分记为4 分；若大鼠出现单侧瘫痪，行走困难，且进食困难行为学评分记为6 分；若大鼠出现完全瘫痪，且不能进食行为学评分记为8 分；若大鼠出现濒临死亡或死亡行为学评分记为10 分。

1.5 样品处理 末次注射后24 h 处死大鼠，迅速取出脑部黑质称重，低温下匀浆，制成10%的组织匀浆液，离心（2000 r/min，5 min），取上清待测。

1.6 黑质中MDA 含量及SOD、GSH-PX 活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法和二硫代二硝基苯甲酸法测定组织匀浆中SOD、GSH-PX 活力，采用硫代巴比妥缩合法测定MDA 含量，具体操作步骤参照试剂盒说明书进行。

1.7 统计学方法 应用SPSS 22.0 统计软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），计量资料以（）表示，组间比较采用检验，以＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠外观行为表现评分比较 对照组大鼠外观行为表现正常；与对照组相比，模型组大鼠出现毛色发黄、姿态不稳的情况，且大鼠会出现弓背状屈曲体姿，四肢部分或全部出现瘫痪，个别有震颤现象，精神萎靡；与模型组相比，Rg3 组大鼠出现毛色较白，姿态稳定的情况，且均未表现弓背状屈曲体姿，无四肢部分或全部出现瘫痪，步态正常稳定，精神正常，自发活动较多，与阳性药物组情况相似；各组大鼠不同时间点行为学评分比较，差异有统计学意义（＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠外观行为表现评分比较（，分）

表1 各组大鼠外观行为表现评分比较（，分）

注：与对照组比较，*＜0.05；与模型组比较，#＜0.05

2.2 各组大鼠黑质MDA 含量比较 与对照组相比，模型组大鼠黑质MDA 含量升高，差异有统计学意义（＜0.05）；与模型组相比，Rg3 组及阳性药物组黑质MDA 含量降低，差异有统计学意义（＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠黑质MDA 含量比较（，nmol/mgprot）

表2 各组大鼠黑质MDA 含量比较（，nmol/mgprot）

注：与对照组比较，*＜0.05；与模型组比较，#＜0.05

2.3 各组大鼠黑质SOD 活性比较 与对照组相比，模型组大鼠黑质SOD 活性降低，差异有统计学意义（＜0.05）；与模型组相比，Rg3 组及阳性药物组黑质SOD活性升高，差异有统计学意义（＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠黑质SOD 活性比较（，U/mgprot）

注：与对照组比较，*＜0.05；与模型组比较，#＜0.05

2.4 各组大鼠黑质GSH-PX 活性比较 与对照组相比，模型组大鼠黑质GSH-PX 活性降低，差异有统计学意义（＜0.05）；与模型组相比，Rg3 组及阳性药物组黑质GSH-PX 活性升高，差异有统计学意义（＜0.05），见表4。

表4 各组大鼠黑质GSH-PX 活性比较（，U/mgprot）

表4 各组大鼠黑质GSH-PX 活性比较（，U/mgprot）

注：与对照组比较，*＜0.05；与模型组比较，#＜0.05

3 讨论

氧化应激指细胞产生和清除自由基的能力失衡，使被氧化修饰的大分子在细胞内堆积，过量自由基还可以引起生物膜上的不饱和脂肪酸形成过氧化脂质，生成大量MDA，对蛋白质、DNA、RNA 及多糖高分子物质等产生氧化、交联、变性和降解，导致膜流动性降低、通透性增高、线粒体肿胀、溶酶体释放生物酶、细胞器及酶的结构和功能破坏。此外，氧化应激可参与脂质过氧化，从而促进PD 的病理过程，目前已在PD 患者的脑内找到氧化应激损伤的证据，包括GSH 水平下降、脂质过氧化增加、多巴醌生成、DNA 损害等[13-15]。

本研究采用R-NLC 构建PD 动物模型，其有助于鱼藤酮更好地发挥作用。鱼藤酮是一种广泛应用于农业的杀虫剂，主要抑制线粒体复合物I，导致机体ATP 合成障碍，小动物如小鼠、大鼠等长期接触鱼藤酮等线粒体复合酶Ⅰ抑制剂可出现类似PD 样病理学及行为学改变，包括黑质纹状体DA 能神经元减少等[16]。鱼藤酮抑制线粒体后引起氧化应激，而线粒体是细胞对氧化应激最敏感的细胞器，自由基可造成线粒体损伤，线粒体损伤反过来进一步加剧氧化应激。实际上，ROS 是鱼藤酮在体内慢性抑制复合体Ⅰ的本质特征[17]。脑组织是机体氧化代谢最活跃的器官，且含有大量易氧化的不饱和脂肪酸，但脑组织内抗氧化相关酶的活性及抗氧化小分子谷胱甘肽的含量较低，特别是在纹状体和黑质内含有大量的多巴胺，多巴胺在自发的或经酶催化的代谢过程中产生氧自由基、过氧化氢等神经毒性物质[18]。实验证明[19]，在PD 模型大鼠黑质纹状体系统受损发生氧化应激的过程中，自由基对生物膜的破坏起了重要作用，使生物膜中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，产生MDA，生物膜结构及通透性改变，生物酶的活性丧失，线粒体、溶酶体等细胞器发生裂解，细胞死亡。在正常的生理状态下，人体代谢产生的自由基可以经自由基清除系统灭活。人体清除自由基的酶主要包括SOD、过氧化氢酶（CAT）、GSH-PX及抗氧化非酶小分子GSH[20]。本研究结果显示，PD大鼠黑质内GSH-PX、SOD 活性降低，而MDA 含量升高，这是由于脂质过氧化反应增强的结果；而Rg3组以及阳性药物组SOD、GSH-PX 活性高于模型组，MDA 含量低于模型组，以上研究结果反映了PD 模型大鼠黑质内抗氧化应激系统功能的减弱，MDA 含量的升高则反映了黑质内氧自由基含量的增多及细胞正处于脂质过氧化的阶段，而人参皂苷Rg3 可能是通过提高机体清除自由基的酶的活力而抑制过氧化反应的。

综上所述，氧化应激参与了PD 的发病机制，Rg3 可以提高机体的抗氧化能力。随着对氧化应激介导的PD 发病机制的深入研究，对PD 抗氧化应激的治疗将得到更多的认识和发展，也为临床治疗和预防PD 提供新的实验依据。