气体信号分子硫化氢介导胃癌多药耐药性研究

陈伟毅，胡 柯，刘 雨，彭 靖，李小成，段绍毅，陈立军，杨骐彰

（1.湖南医药学院医学院，湖南 怀化 418000；2.湖南医药学院第一附属医院普外科，湖南 怀化 418000）

胃癌（gastric cancer）是消化系统常见的恶性肿瘤之一，全国肿瘤中心数据显示，胃癌发病人数和死亡人数均居所有恶性肿瘤第2 位，已严重危害我国居民健康[1]。化疗是治疗胃癌的主要方法之一，然而胃癌对化疗并不敏感，目前应用的多种药物以及多种给药方案的总体疗效评价很不理想[2]。化疗失败主要是由于胃癌对化疗药物产生了多药耐药性（multidrug resistance，MDR）[3]。胃癌多药耐药的产生严重影响了化疗在胃癌治疗中的效果，如何逆转多药耐药已成为胃癌治疗中的一个关键问题。硫化氢（hydrogen sulphide，H2S）是一种新的内源性气体信号分子，具有多种生理、毒理和药理作用，如调节离子通道的开放和关闭、抑制细胞增殖、抗氧化应激、舒张平滑肌、抗内质网应激等[4]。研究表明[5]，H2S 可以促进肿瘤耐药性，但H2S 对胃癌耐药性的影响目前尚未明确。本研究拟探讨H2S 与胃癌多药耐药的关系，为逆转胃癌多药耐药提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 RPMI 1640、胎牛血清（美国Gibco公司），顺铂（齐鲁制药有限公司），阿霉素（深圳万乐药业有限公司），5-氟尿嘧啶（海南卓泰制药有限公司），CCK8 试剂盒（碧云天公司），BCA 蛋白定量试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），NaSH（美国Sigma公司），胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-synthase，CBS）抗体、β-actin 抗体（美国CST 公司）。

1.2 仪器 UV2450 型亚甲基蓝分光光度计（日本SHIMADZU 公司），AE2000 型光学倒置显微镜（美国Motic 公司），Mini-PROTEAN Tetra 型聚丙烯酰胺垂直电泳系统、ChemiDoc XRS+型凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）。

1.3 细胞及培养 人胃癌MGC803 细胞购于中科院上海细胞库，用含有10%的胎牛血清的RPMI 1640，培养于37 ℃、5% CO2孵箱中，每48 h 用0.25%的胰酶消化传代进行后续实验。

1.4 方法

1.4.1 顺铂诱导多药耐药胃癌细胞株的建立 取对数生长期的胃癌MGC803 细胞，用含1 mg/L 顺铂的培养基培养48 h 后更换为不含顺铂的培养基继续培养。待细胞恢复活力后，用含相同浓度顺铂的培养基继续培养，直至细胞能够在含1 mg/L 顺铂的培养基里稳定生长。采用同样的方法将顺铂浓度逐步提高为2、3、4、5 mg/L，最终建立耐5 mg/L 顺铂的胃癌多药耐药细胞MGC803/MDR，倒置显微镜观察细胞形态并拍照。

1.4.2 细胞分组及处理 将MGC803/MDR 细胞随机分成对照组和氨基氧乙酸（AOAA）组，AOAA 组予以1 mmol/L AOAA 处理24 h，对照组予以等量的培养基处理24 h。另取MGC803 细胞随机分成对照组和NaSH 组，NaSH 组予以200 μmol/L NaSH 处理24 h，对照组予以等量的培养基处理24 h。

1.4.3 CCK8 法计算IC50值 取对数生长期的胃癌MGC803 或MGC803/MDR 细胞以每孔1×105/ml，100 μl/孔接种在96 孔板中，常规培养细胞达到板底80%，分别予以0、1、2、3、4、6 mg/L 顺铂、5-氟尿嘧啶、0、0.5、1、1.5、2 mg/L 阿霉素处理24 h 后，吸去培养液，每孔加入含10 μl CCK8 的培养液110 μl，同时在空白孔内加入含10 μl CCK8 的培养液110 μl 进行空白对照，继续孵育1 h，酶标仪检测450 nm 出吸光度OD 值，计算细胞活力=（加药孔OD 值-空白孔OD值）/（不加药孔OD 值-空白孔OD 值）×100%，采用改良寇式法计算IC50值[6]。

1.4.4 亚甲基蓝分光光度计法检测H2S 含量 取对数生长期的胃癌MGC803 或MGC803/MDR 细胞以每孔1×106/ml，500 μl/孔接种在24 孔板，收集细胞培养基于含2%醋酸锌30 μl 离心管中，超声波裂解细胞后将其置于之前的离心管中，采用亚甲基蓝分光光度计法检测H2S 含量[7]。

1.4.5 Western blot 检测蛋白表达 提取细胞蛋白，采用BCA 法测量蛋白浓度，每组取60 μg 蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将蛋白转移到NC 膜上，封闭后加入一抗4 ℃过夜，再加入二抗孵育2 h，曝光显影，以β-actin 作为内参，采用Quantity one软件分析蛋白表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS 26.0 软件进行统计分析，实验数据均以（）表示，两两比较采用独立样本检验，＜0.01 视为统计学意义显著。

2 结果

2.1 细胞形态学观察 采用倒置显微镜观察细胞形态：MGC803 细胞形态规则，呈多边性或三角形，胞体较大，细胞之间连接紧密，边界清晰。MGC803/MDR细胞排列松散，细胞之间界限不清，胞体较小，细胞形态呈梭形或不规则形，见图1。

图1 胃癌细胞形态观察（×200）

2.2 两种胃癌细胞株IC50值 MGC803/MDR 细胞对顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶的IC50值高于MGC803细胞（＜0.01），见图2。

图2 两种胃癌细胞株IC50 值

2.3 两种胃癌细胞株H2S、硫化氢生成酶CBS 表达MGC803/MDR 细胞H2S（91.8±4.36）、CBS（0.85±0.02）表达高于MGC803 细胞（62.53±1.86）、（0.32±0.01）（＜0.01），见图3。

图3 两种胃癌细胞CBS 表达

2.4 AOAA 对MGC803/MDR 细胞H2S 表达和IC50值的影响 采用CBS 抑制剂 AOAA 作用于MGC803/MDR 细胞24 h 后，H2S 生成显著减少，见图4A；对顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶的IC50值显著降低，见图4B。

图4 AOAA 对H2S 表达和IC50 值的影响

2.5 NaSH 对MGC803 细胞IC50值的影响 采用NaSH（外源性H2S）作用MGC803 细胞24 h 后，MGC803 细胞对顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶的IC50值显著升高，见图5。

图5 NaSH 对MGC803 细胞IC50 值的影响

3 讨论

胃癌多药耐药的产生严重影响了化疗在胃癌治疗中的效果，并导致肿瘤复发和转移，引起胃癌治疗失败[8，9]。如何逆转多药耐药已成为胃癌治疗中的关键问题[10]。H2S 是机体内一种新型气体信号分子，具有分子量小、扩散快、效应广等特点[11，12]。研究表明，H2S 与肿瘤耐药形成有关[5]，但其与胃癌多药耐药的关系目前尚未明确。本研究拟探讨H2S 与胃癌多药耐药的关系，为防治胃癌多药耐药提供新的思路。H2S 是继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）后第3 种气体信号分子，广泛参与多种生理和病理过程[13，14]。近来越来越多的文献报道H2S 与肿瘤耐药相关，如Untereiner AA 等[15]发现H2S 和CBS 在5-氟尿嘧啶耐药结肠癌细胞中显著上调，Bhattacharyya S 等[16]报道CBS 可以促进卵巢癌细胞对顺铂耐药，Wang L等[17]发现CBS 过表达可引起肝癌细胞对多柔比星和舒尼替尼产生耐药。上述研究表明H2S 与多种肿瘤耐药密切相关，但H2S 与胃癌耐药的关系尚未明确。

本研究首先采用药物浓度递增法建立了胃癌多药耐药细胞株MGC803/MDR。通过CCK8 实验发现MGC803/MDR 细胞对顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶的IC50值显著高于MGC803 细胞，表明其具有多药耐药性。其次通过亚甲基蓝分光光度计法、Western blot 等实验发现MGC803/MDR 细胞H2S 含量、H2S生成酶CBS 表达高于MGC803 细胞，表明MGC803/MDR 细胞多药耐药性与H2S 生成增多有关。之后采用CBS 抑制剂AOAA 降低MGC803/MDR 细胞H2S后，发现MGC803/MDR 细胞H2S 生成减少，同时对顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶的IC50值降低，表明抑制H2S 生成可以逆转MGC803/MDR 细胞的多药耐药性。为了进一步验证H2S 对胃癌多药耐药的影响，给予MGC803 细胞NaSH（外源性H2S）处理，发现在NaSH 的作用下，MGC803 细胞对顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶的IC50值升高，表明增加H2S 生成可以促进MGC803 细胞多药耐药性。上述研究结果表明H2S介导了胃癌细胞多药耐药性的形成。

有研究报道[18]，内源性H2S 可以促进人胃癌细胞增殖。另有文献报道[19]，抑制H2S 生成可以减少胃癌血管生成。此外，有资料发现[20]，降低H2S 生成可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移。本实验发现升高H2S浓度可以促进胃癌多药耐药，降低H2S 浓度可以逆转胃癌多药耐药，表明H2S 介导了胃癌的多药耐药，H2S 可能是防治胃癌多药耐药的一个新的靶点。

综上所述，本研究发现H2S 介导了胃癌的多药耐药的形成，发掘了胃癌多药耐药形成的新机制，为防治胃癌多药耐药提供了新的思路。然而，本研究也有一些不足之处，比如只进行了体外细胞实验验证，没有进行体内动物实验验证，以及H2S 通过何种途径介导胃癌多药耐药，其机制还需进一步研究。