基于SSR标记的黑龙江省茖葱天然种群遗传多样性分析

臧丹丹,姜思佳,周玉迁* , 赵恒田,王宁

(1.中国科学院东北地理与农业生态研究所, 哈尔滨 150081;2.黑龙江省森林植物园,哈尔滨 150040)

茖葱(AlliumvictorialisL.)是一种多年生草本植物,广泛分布于北半球。在中国,茖葱主要分布在东北、内蒙古、河北等北方地区。茖葱作为一种药食兼用植物,具有良好的发展前景。近年来,随着茖葱的营养价值和有效成分研究的深入,茖葱的经济价值持续得到关注[1-3]。此外,茖葱在黑龙江省分布较广,但随着人类活动和自然环境的破坏等情况的发生,茖葱的野生种群数量逐渐减少,对茖葱种质资源的保护和利用也变得越来越重要。遗传多样性是生物种群适应环境变化和进化的基础,也是种质资源保护和利用的重要基础。因此,对茖葱遗传多样性的研究具有重要的理论和实践意义[4]。

茖葱含有许多活性成分,包括挥发油类物质、黄酮类化合物、糖类物质、丰富的维生素、可溶性蛋白、纤维素、微量元素等,在保护心血管系统、消炎、保护肝脏、抵御肥胖方面功效显著。茖葱作为一种重要的药食兼用植物,被广泛应用于中药制剂和保健品中。因此,茖葱的种质资源保护和利用具有很高的经济和社会价值。对于茖葱研究目前主要停留在活性成分开发、提取工艺优化、外部形态、核型分析等方面,在分子生物学和遗传多样性评价方面研究较少,且有关茖葱育种研究相对滞后,严重制约了茖葱产业化发展。

分子DNA标记是种质资源遗传多样性分析最有用工具之一。分子标记技术主要用于遗传多样性研究、分子辅助选择(MAS)、亲子关系分析、数量性状基因(QTL)定位、品种鉴定、系统发育关系和遗传图谱等。各种分子标记均可用于开发茖葱遗传研究,包括简单序列重复(SSRs)、简单序列间重复(ISSRs)、限制性片段长度多态性(RFLP)[5]、多态性DNA的随机扩增(RAPD)[6]、扩增片段长度多态(AFLP)[7]和单核苷酸多态性(SNPs)[8]。其中,SSR非常有利于茖葱遗传学研究和育种中的各种应用,因为它们是多等位基因、共显性、信息量高、相对丰度高、基因组覆盖率高,并且实验可重复[8-10]。SSR标记已广泛应用于基础和应用领域,包括个体、群体、品种和物种水平的遗传分析[9]。近年来,SSR分子标记技术已全面应用于相同植物不同种质间的遗传多样性研究中,如番石榴、印度蓖麻、杏仁、板栗[11-12]等。而SSR分子标记技术在茖葱种源遗传多样性分析方面研究尚属首次。通过对茖葱种群的遗传多样性水平、遗传结构和遗传分化进行分析,我们可以深入了解茖葱的遗传背景、遗传多样性水平以及茖葱种群的空间分布特征,为茖葱资源的保护和利用提供科学依据。

从54对SSR引物中,筛选出多态性优良的引物33对,对24个黑龙江省主要野生茖葱种源群进行了遗传多样性分析,并通过聚类分析将其归类,以揭示不同种源地茖葱群体间的亲缘距离远近,为下一步的茖葱野生资源多样性保护、优良茖葱品种培育奠定理论基础,对野生茖葱资源的保护及茖葱产业发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从黑龙江省采集不同茖葱种源地的24份茖葱,如表1所示。

表1 黑龙江省茖葱采集位置

1.2 实验方法

1.2.1 不同种源地茖葱基因组DNA获取。采集幼嫩、无病虫害的不同种源地的茖葱叶片放于液氮中保存利用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒对上述保存在液氮中的茖葱叶片提取DNA,分析上述提取DNA的浓度和纯度,将没有降解的DNA保存于-20 ℃冰箱以备后续使用。

1.2.2 SSR引物合成。用于试验的引物均由上海生工有限公司合成(如表2所示)。

表2 引物序列信息

1.2.3 PCR扩增与电泳检测。茖葱PCR扩增总体系为20 μL:新鲜茖葱DNA 2 μL, 2×Taq PCR MasterMix 10 μL;正向引物F(10μM) 1 μL;反向引物R(10 μM)1 μL;ddH2O 6 μL。

PCR反应程序:94 ℃预变性3 min,

94 ℃变性30 s;

53～65 ℃退火 30 s;30个循环

72 ℃延伸1 min;

72 ℃延伸7 min, 置于4 ℃保存备用。

PCR产物聚丙烯酰氨凝胶电泳检测:扩增产物及DNA Maker点样于8%的聚丙烯酰氨凝胶上,连接电源进行电泳检测。电泳结束后用硝酸银对上述凝胶染色,染色成功后即可得到结果,照相保存凝胶电泳图片。DNA maker购自Takara有限公司。

1.2.4 数据统计与分析。观察扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶上的电泳迁移情况,分别以“1”和“0”表示同一区域条带的有无,建立数据统计的原始数据库。用NTSYS-pc V2.1软件计算不同茖葱种源间的遗传距离,用SAHN和UPGMA方法对24种不同茖葱种源进行聚类分析,并通过Tree plot模块建立聚类图片。

2 结果与分析

2.1 扩增情况

33对引物在24份茖葱种质中均能获得清晰条带。图1为引物44的扩增情况图片。

注:泳道1～24编号见表1;M为Marker

图2 黑龙江茖葱遗传多样性分析

2.2 遗传多样性分析

通过不同种质间两两个体之间的亲缘关系远近可以判定群体之间遗传多样性丰富情况。研究所涉及的24份不同种源茖葱品种间遗传距离在0.0000～0.6667之间。其中宝清林业局茖葱与其他品种的遗传距离在0.1806～0.5694,表明宝清林业局茖葱与其他品种茖葱亲缘关系较远。使用UPGMA法对不同种源的24种茖葱进行聚类分析,得到一个可以判定茖葱亲缘距离远近的树状图(图1),从图中可知茖葱主要分为两大类群。第Ι类群包括16份种质,分别来源于鹤北金矿林场、同江前进农场、伊春红星林业局汤北林场、抚远大峰场林场、虎林七虎林场、饶河大顶子山、伊春-友好林业局三合林场、汤旺河日新、沾河-沾中林场、密山856农场、伊春-五营翠北林场、伊春-新春林业局北沟林场、沾河-幸福林场、依兰林业局烟囱山林场、鹤岗筒子沟林场、宝清林业局东方红林场。第Ι类群又分为两个亚类,亚类Ι包括:鹤北金矿林场、同江前进农场、伊春红星林业局汤北林场、抚远大峰场林场、虎林七虎林场、饶河大顶子山、伊春-友好林业局三合林场、汤旺河日新、沾河-沾中林场、密山856农场、伊春-五营翠北林场、伊春-新春林业局北沟林场、沾河-幸福林场、依兰林业局烟囱山林场,说明以上14份茖葱亲缘关系相近。亚类Ⅱ包括:鹤岗筒子沟林场、宝清林业局东方红林场,说明上述两份茖葱亲缘关系最近。第Ⅱ类群包括6份种质,分别来源于八面通林业局纯盛经营所、宝清林业局、老黑山、吉林敦化、鸡西柞木林场、穆棱林业局莲河林场、绥阳双芽子林场、绥阳暖泉河林场。第Ⅱ类群同样包括两个亚类,亚类Ι包括:八面通林业局纯盛经营所、宝清林业局两份茖葱种质,说明这两份茖葱亲缘关系近于其他种质;亚类Ⅱ包括老黑山、吉林敦化、鸡西柞木林场、穆棱林业局莲河林场、绥阳双芽子林场、绥阳暖泉河林场等6份种质。

3 讨论

研究利用33对SSR引物对24份不同茖葱种质的亲缘距离远近进行分析,结果表明,黑龙江省不同茖葱种源间遗传距离较远,具有丰富的遗传多样性。对24份不同茖葱种源分析可以看出其主要分为两大类群Ⅰ和Ⅱ,第Ⅰ类群和第Ⅱ类群又各分为2个亚类群,聚类结果表明不同茖葱种源间亲缘距离远近与其种植位置有一定关联,但并非完全相同。

茖葱主要分布于北半球(欧亚大陆、美洲)等地[13]。茖葱最原始种为二倍体,现存二倍体、三倍体、四倍体三种类型种群[4]。在我国茖葱主要分布于东北三省、内蒙古、河北、山西、陕西、湖北、河南等地,其生长地点与海拔高度和纬度有很大关系,海拔高度随纬度增加而降低[15-16]。目前有关鉴定茖葱品种亲缘关系远近的报道,主要通过以下几种方法:(1)从形态学上通过解剖不同品种茖葱种群,对茖葱的不同组织器官(鳞茎、叶片、花、种子等)等仔细观察和测量,区分不同种质。(2)初步判定茖葱染色体为8 n,核型为2A型,通过染色体形态和核型分析,辨别不同种质之间关系[17]。

不同种质资源间生理形态会有一定区别,但也可能区别不是很明显,导致在进行生理生态表型或者指标的测定时无法直接检测出,此时从核酸角度进行分析,即利用SSR等分子标记方法进行种质资源多样性研究,是弥补农艺性状差别不大的最佳方法。SSR标记是鉴于DNA的特异性标记方法,其引物具有可重复强、多态性好、稳定性佳等特点。

研究中的24份种质资源被分为2大类,通过聚类结果可知,茖葱种质资源亲缘关系受地理资源影响不大,可能与茖葱叶型、结实早晚、抽薹高度等相关农艺性状有一定相关性,所以在后续研究中应该关注茖葱的农艺性状,可将农艺性状与SSR等分子标记方法相结合,进一步阐明茖葱的农艺性状是否与茖葱亲缘关系的远近有关联性。

综上所述,SSR标记技术可从分子角度阐明黑龙江省不同种源地野生茖葱群体间丰富的遗传多样性和亲缘距离远近,茖葱种质间亲缘关系与地理来源关系不大,可能与茖葱农艺性状有一定相关性。种质聚类结果可为了解黑龙江省不同种源地茖葱品种亲缘关系远近提供了技术支持,也为进一步研究和利用这些茖葱种质资源奠定良好的理论基础。

通过对茖葱遗传多样性的深入研究,可以更好地了解茖葱的遗传背景,为茖葱资源的保护和利用提供科学依据。此外,对茖葱种群的遗传结构和遗传分化进行研究,可以为茖葱的遗传改良和育种提供重要参考。茖葱的遗传多样性研究是当前生态保护和生物多样性研究领域的热点问题,也具有重要的理论和实践意义。通过研究,更好地了解黑龙江省内茖葱天然种群的遗传多样性,为促进茖葱产业的发展和茖葱资源的保护提供科学依据。