两种孕酮缓释栓对比研究

2023-10-23杨青通曹高寨姚珍珍邵亚群

中国乳业 2023年9期

关键词：原研受胎率黄体酮

陈勇，杨青通，曹高寨，李强，姚珍珍，邵亚群

1 宁波三生生物科技股份有限公司，浙江宁波 315171

2 新郑市亚峰奶牛场，河南郑州 451162

3 郑州牧之堂兽药有限公司，河南郑州 452370

0 引言

黄体酮为脂溶性孕激素，除众所周知的保胎、对抗雌激素抑制发情排卵外，还有更重要的作用和应用。目前黄体酮在奶牛繁殖管理中主要用于定时输精处理，在同期排卵（Ovsynch）流程前7 天提高优势卵泡发育期间的孕酮水平，可确保优势卵泡中卵母细胞质量，使之排卵后获得高质量卵子，继而在受精后形成存活能力强的胚胎，减少后续整个妊娠期的妊娠损失率[1～4]。同时该阶段内的高孕酮水平还可通过负反馈对GnRH合成分泌产生抑制，减少两个或多个优势卵泡共生现象，最终通过减少双排卵反应，控制实际生产中的双胎率[5～7]。

另外，奶牛受精后的14 天是胚胎和母体建立联系的关键时期，如能提高体内孕酮水平、降低雌二醇水平，可提高后续妊娠成功率[8]。

奶牛注射黄体酮后血药浓度迅速升高，超出生理水平，并通过血乳屏障比例升高，使进入牛奶中的孕酮量增加。经代谢血药浓度快速下降，注射给药黄体酮血药浓度波动大、不稳定[1，9]。出于食品安全考虑，目前注射剂型黄体酮已在泌乳期禁用[10]。实际生产中使用制剂为黄体酮硅胶缓释栓，是以尼龙为骨架，以医用硅胶为载体，将黄体酮按适当比例置于熔化的医用硅胶内，经混匀、冷却后形成含有黄体酮的硅胶膜，之后包裹于骨架外。每支孕酮栓内含黄体酮1.38 g[11～13]。黄体酮硅胶缓释栓放置于奶牛阴道内，硅胶膜内的黄体酮通过缓释微孔持续缓慢释放，并通过阴道黏膜吸收进入体内而发挥作用[14，15]。黄体酮硅胶缓释栓的主要应用方案是在Ovsynch流程中的前7 天或前5 天（后备牛0568流程），提高该期间优势卵泡发育过程中的孕酮水平，从而提高卵母细胞质量和排卵后卵子质量，使之在受精后产生存活能力较强的胚胎，以及在输精后第14天前后提高奶牛体内孕酮水平，提高子宫内环境，使胚胎安全度过与母体产生联系的关键时期，提高妊娠成功率[16～19]。

本次试验对比选择奶牛繁殖管理的两个阶段，进行原研孕酮栓和喜达栓的7 天和累计14 天的放置，对比药物释放量、体内孕酮水平变化及其他繁殖数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

注射用戈那瑞林（生源）、氨基丁三醇前列腺素F2α（谛诺）、黄体酮硅胶缓释栓（喜达：黄体酮含量1.38 g/支），宁波三生生物科技股份有限公司；黄体酮硅胶缓释栓（黄体酮含量1.38 g/支），进口原研产品。

1.2 试验动物和分组

本次试验分两组，第1组选取牧场正常参配牛22 头，随机按照耳标编号末位数奇偶数分为两组，两组牛的产后天数、配次、胎次、产量等基础状况平衡基本一致，饲养在同一牛舍、同一组内。耳标奇数组为试验组，使用喜达栓；耳标偶数组为对照组，使用原研孕酮栓。第2组，缓释栓的第2次利用，在第1组试验结束时选取输精后11 天的奶牛，按照耳标编号末位数奇偶数随机分为两组，两组牛的产后天数、配次、胎次、产量等基础状况平衡，基本一致，饲养在同一牛舍、同一组内。偶数组为试验组，采用使用过1 次（7 天）的喜达栓；奇数组为对照组，采用使用过1 次（7 天）的原研孕酮栓。

1.3 试验方法

1.3.1 第一次使用对比

具体处理：6月12日上午7点，牧场产后符合定时输精处理及检胎空怀牛，剔除流产、乳房炎、腹泻、蹄病等临床发病牛及不正产牛后，剩余健康牛22 头参与试验。按照耳标号的奇、偶数分组，奇数（喜达栓）组12 头，偶数（原研孕酮栓）组10 头。采用Ovsynch流程处理，在0 天（6月12日）注射GnRH，同时根据分组放置不同厂家的黄体酮硅胶缓释栓，放栓前牛体外阴用75%酒精喷洒消毒，纸巾擦干，石蜡油做润滑剂。放栓前牛尾中央静脉采血5 mL，分离提取血清后冷冻保存。放栓48 h后（6月14日）所有试验牛再次经尾中央静脉采血5 mL，分离提取血清后冷冻保存；7 天后（6月19日）上午7点试验牛撤除硅胶栓，同时注射氨基丁三醇前列腺素F2α5 mL，并经尾中央静脉采血5 mL，分离提取血清后冷冻保存。将撤除的两组硅胶栓各随机选取两枚送往检测机构，检测栓内黄体酮残留比例。6月21日下午3点，试验牛注射GnRH100 μg，6月22日上午7点所有试验牛定时输精，之后按照牧场繁殖管理流程发情揭发和检胎。处理流程见表1。

表1 试验牛同期处理-定时输精流程

1.3.2 第二次使用对比

具体处理：6月19日，将撤除的黄体酮缓释栓用流水洗刷干净，尤其是缓释栓定位孔内的分泌物，擦干后放置于0.1%新洁而灭溶液浸泡30 min左右。选取输精后11 天的已配待检牛，按照耳标编号的奇偶数分组，本次偶数组放置喜达栓，奇数组放置原研黄体酮缓释栓。在放置缓释栓前，于尾中央静脉采血5 mL，分离提取血清后冷冻保存，48 h后（6月21日）试验牛再次从尾中央静脉采血5 mL，分离提取血清后冷冻保存。7 天后（6月26日）试验牛再次从尾中央静脉采血5 mL，分离血清后冷冻保存，并撤除黄体酮缓释栓，之后按照牧场繁殖管理流程发情揭发和检胎。撤除的两组硅胶栓及收集的所有血清送往检测机构检测栓内黄体酮残留比例。

1.4 数据处理

试验过程中如有发病牛则剔除试验，如在检胎前未返情淘汰的奶牛剔除试验受胎率的对比，但放栓过程血中黄体酮浓度检测数据仍参与相关分析对比。检胎前返情牛记录为空怀牛，参与情期受胎率的数据对比，血中黄体酮浓度检测数据参与相关分析对比。

参与试验的牛群中无发病、淘汰牛。血中黄体酮浓度变化、受胎率、栓内黄体酮残留率等数据经卡方检验分析组间差异度。P＞0.05差异不显著，P＜0.05差异显著，P＜0.01差异极显著。

2 试验结果及分析

试验牛血清使用荧光试剂盒检测黄体酮浓度，单位为mmol/mL，撤下的黄体酮缓释栓使用液相检测法测定栓内黄体酮含量。两种硅胶缓释栓在两组试验中撤栓时都有白色分泌物，无差异。该现象为阴道黏膜的正常排异反应，未特殊处理。所有奶牛在输精后28～34 天采血，做配后初次妊娠诊断。

2.1 不同孕酮栓处理后对奶牛体内孕酮水平的影响

不同黄体酮缓释栓使用后孕酮血药浓度变化、受胎等数据见表2。两组奶牛放栓前以及放栓过程中孕酮水平的变化趋势均无差异（P＞0.05）；受胎率对比：喜达栓组受胎率50%（6/12），原研孕酮栓组受胎率20%（2/10），无显著差异（P＞0.05）；空怀牛返情率对比：喜达组未孕牛返情率50%（3/6），原研孕酮栓组未孕牛返情率37.5%（3/8），差异不显著（P＞0.05）。

表2 孕酮栓处理后奶牛体内孕酮变化及结果单位：mmol/mL

经黄体酮缓释栓处理后孕酮上升比例较大。因试验过程未检查卵巢，不能明确处理之初及过程中卵巢功能性结构变化。但根据黄体酮缓释栓处理之初和处理过程中体内孕酮水平变化可推断，处理之初3 头牛卵巢应该不存在有效黄体，并且在注射GnRH后也未发生排卵继而产生有效黄体，所以7 天后黄体酮缓释栓处理结束后体内孕酮水平的变化主要归功于黄体酮缓释栓的使用，但撤栓时会有所回落。这是因为栓释放的孕酮经阴道黏膜吸收后会导致体内孕酮水平升高，尤其是初期栓表面的孕酮较容易游离释放，而相对较深层孕酮释放速率下降，阴道表面可吸收孕酮量随之减少[20]，所以后续体内孕酮水平回落。

另外，开始试验处理时体内孕酮水平处于较低水平（＜2 mmol/mL）的8 头牛（含＜0.67 mmol/mL的3头牛），处理过程孕酮水平持续升高的3 头牛中两头为产后首配牛（泌乳天数45 天、57 天）。该群体开始处理时多数为卵巢静止或处于性周期活动的非黄体期，7 天黄体酮缓释栓处理结束时处于黄体（早）期。该群体总体有效（受胎或自然返情都视为有效）率尚可，有效率为50%，可见黄体酮缓释栓对卵巢机能调整结果较理想。该群体相关数据见表3。

表3 开始处理时较体内低孕酮水平群体统计单位：mmol/mL

2.2 两种黄体酮缓释栓二次利用对比

所有奶牛在输精后28～34 天采血，做配后初次妊娠诊断，结果见表4。两组数据体内孕酮水平变化过程、受胎率、空怀牛返情率等，差异不显著（P＞0.05）。在放置黄体酮栓7 天后撤栓时为输精后的第18天（6月26日），初检空怀牛输精后18 天时的孕酮水平，较输精后11 天（6月19日）或13 天（6月21日）多数呈显著下降趋势。由于体内有黄体酮缓释栓持续释放孕酮，使空怀奶牛输精的第后18 天时没有出现体内孕酮水平过低（＜2 mmol/mL）。输精后11 天孕酮仍处于低水平（＜21 mmol/mL）的奶牛，初检都空怀，可见输精后14 天左右胚胎与母体建立联系的关键时期体内孕酮水平的高低与之后的妊娠成功率相关性极大。如果输精后14 天左右奶牛遭受应激或健康问题，黄体功能受损或之前黄体功能不足及黄体发育不良等，导致体内孕酮水平没有足够高或降低，都会妊娠失败[21，22]。

表4 黄体酮缓释栓第2 次使用后血中孕酮水平变化和受胎情况单位：mmol/mL

本试验开始时测定的体内孕酮水平为发情后11天的黄体分泌孕酮能力所致，明显较Ovsynch流程放置黄体酮栓处理7 天时体内孕酮水平高，与泌乳期奶牛性周期体内孕酮水平变化规律一致：排卵后随黄体生成和发育，体内孕酮水平逐渐升高，至性周期的14 天时为7 天时的2 倍左右。

从喜达栓首次使用7 天结束时奶牛体内孕酮水平、奶牛输精后11 天时自身黄体产生孕酮导致体内孕酮水平对比看，放置黄体酮缓释栓的奶牛体内孕酮浓度极显著低于自身黄体所产生的孕酮浓度（P＜0.001），证明使用黄体酮缓释栓在食品安全是有保障的[10]。

2.3 两种缓释栓的黄体酮残留率（释放效率）对比

将使用过7 天、14 天的黄体酮缓释栓做栓内黄体酮残留量检测，计算各次使用后的残留率，结果如表5所示，两种黄体酮缓释栓经两次使用后栓内黄体酮残留率对比差异不显著（P＞0.05）。

表5 两种黄体酮缓释栓使用后的孕酮残留率（基数以1.38 g 计）

黄体酮缓释栓第1 次使用后释放比例为32%～38%，第2次使用后释放比例为20%～28%，与缓释栓深层次部位黄体酮释放困难度增加相关。放栓后黄体酮释放速率呈先高后低的“衰减”模式，这也与生产中第2次使用孕酮栓时的受胎率较新栓会降低的实际状况一致。

本次试验未孕牛的返情率较低，两组试验牛初检时怀孕率为50%（15/30），初检情期受胎率为39.47%（15/38），与当时严重的热应激和牧场防暑降温工作不利等因素相关[23，24]。但热应激相对较轻的试验前两周的返情率相似，初检检出率为47.73%（21/44），初检情期受胎率为33.87%（21/62）。