表面改性微芯片电泳分离分析保健品中的功效成分

刘惠珍, 陈雅莉, 夏 凌, 肖小华, 李攻科

(中山大学化学学院, 广东 广州 510006)

微芯片电泳(microchip electrophoresis, MCE)的分析效率比普通毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)高,且MCE系统试剂和样品消耗量少、易于高度集成、有助于现场分析,在生物医学和药物分析[1]、环境监测[2]、法医调查[3]和临床诊断[4]等方面应用广泛。

微芯片表面改性方法包括静态涂层改性和动态涂层改性。动态涂层通过在缓冲液中添加聚合物或表面活性剂改变电渗流(electroosmotic flow, EOF)来实现,操作方便且过程可逆,但涂层容易脱落。静态涂层改性是电泳微芯片最有效的表面改性方法,涂层稳定且可提高电泳重现性。常见静态涂层改性方法包括紫外接枝法[5]、等离子处理法[6]和多层化学沉积法[7]。采用阴离子静态涂层[8]对微通道进行改性,能产生阳离子EOF,用于阳离子分析物分离。保健品中常见的阳离子氨基酸有γ-氨基丁酸和赖氨酸。γ-氨基丁酸是哺乳动物中枢神经系统中主要的抑制性神经递质,它影响大脑发育,在促进神经元发育、预防失眠等方面发挥重要作用[9]。口服赖氨酸能增加生长激素释放,有助于人体钙吸收和肾脏保护,增加骨胶原交联过程[10]。阴离子静态涂层可提高MCE对阳离子氨基酸的分离效果,但不适用阴离子氨基酸分析。采用动/静态涂层结合的环烯烃共聚物(cycloolefin copolymer, COC)微通道表面改性方法,可提高MCE对阴离子氨基酸的分离效果。牛磺酸和天冬氨酸等阴离子氨基酸常作为有消除疲劳、提高记忆力等功效的保健品中的功效成分。牛磺酸是重要神经递质、抗氧化剂,能调节葡萄糖和脂质,影响能量代谢[11],常被添加到婴儿食品和运动饮料中,是合法的食品添加剂[12]。天冬氨酸是有酸性侧链的蛋白源性氨基酸,能刺激神经元受体,是哺乳动物大脑中主要兴奋性神经递质[13],它参与葡萄糖生成,可维持正常能量代谢,对瞬时脑力劳动负荷后能量修复有积极作用[14]。γ-氨基丁酸和赖氨酸常用检测方式包括高效液相色谱法(HPLC)[15]、比色法[16]、荧光传感器检测[17]、电化学检测[18]、CE[19]等。而牛磺酸和天冬氨酸检测方法有色谱法[20]、CE[21]、电化学法[22]、核磁共振法[23]等。

本研究采用光学性能好、惰性且低成本的COC作为MCE芯片基底材料,在COC微芯片通道表面通过疏水氨基酸吸附、戊二醛(glutaraldehyde, GA)固定化和亲水氨基酸功能化构建静态涂层,提高阳离子分析物的MCE分离效果,结合激光诱导荧光(laser-induced fluorescence, LIF)检测,用于儿童保健品中赖氨酸与γ-氨基丁酸MCE分离分析;采用动/静态涂层结合微芯片通道表面改性方法,通过缬氨酸吸附、羧基活化和乙二胺(ethylenediamine, EDA)功能化在COC微通道构建静态涂层,向微通道引入含有羟丙基甲基纤维素(hydroxypropyl methyl cellulose, HPMC)与十二烷基硫酸钠(sodium lauryl sulfate, SDS)的缓冲液形成动态涂层,提高阴离子分析物MCE分离性能,结合LIF检测,用于运动饮料中天冬氨酸与牛磺酸的分离分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

HVS448高压电源(美国LabSmith公司); DS-Ri2 CCD摄像机和ECLIPSE Ti2-U倒置荧光显微镜(日本尼康株式会社); FA 1604电子天平(上海天平仪器厂); CNC数控雕刻机(深圳市捷丰泰科技有限公司);自制LIF检测器(由455 nm激光二极管、505 nm DM505二色镜、520 nm BP520长通滤波器和AD500-8-TO52S2雪崩光电二极管构成); USB-6002多功能数据采集卡(National Instruments, USA); LC-2010C HT高效液相色谱仪(日本岛津株式会社); TGL-20M高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司); ESCALab250 X-射线光电子能谱仪(XPS,赛默飞,美国); DSA100接触角测量仪(克吕士,德国); JSM-6330F冷场发射扫描电镜(field emission scanning electron microscope, SEM,日本电子株式会社,日本)

丙氨酸(alanine, Ala, 99%(纯度,下同))、缬氨酸(valine, Val, 99%)、亮氨酸(leucine, Leu, 99%)、异亮氨酸(isoleucine, Ile, 98%)、甲硫氨酸(methionine, Met, 99%)、脯氨酸(proline, Pro, 99%)、色氨酸(tryptophan, Try, 99%)、苯丙氨酸(phenylalanine, Phe, 99%)、天冬氨酸(aspartic acid, Asp, 98%)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA, 98%)、赖氨酸(lysine, Lys, 98%)、精氨酸(arginine, Arg, 99%)和牛磺酸(taurine, Tau, 98%)购于百灵威科技有限公司(北京)。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC, 98%)、N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxy succinimide, NHS, 98%)、硼砂(99%)和SDS(≥98.5%)、磷酸二氢钠(99.9%)、氢氧化钠(97%)与乙腈(色谱级)购于阿拉丁试剂有限公司(上海)。4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑(4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole, NBD-F, 99%)、HPMC(USP2910, 2%)购于上海麦克林生化有限公司(上海)。GA(50%)购于BBI生命科学有限公司(上海)。磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.2～7.6 (1×))购于赛国生物科技有限公司(广州)。碳酸氢钠(99%)、EDA(99%)、三水合乙酸钠和甲醇(色谱级)购于广州化学试剂厂,实验用水均为由Millipore纯化系统得到的超纯水(18.25 MΩ·cm)。C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,北京DiKMA科技有限公司)。儿童保健品(压片糖果)和运动饮料购于零售店。

1.2 微芯片制作

COC微芯片通过数控铣床机械雕刻法建立微通道,使用打孔器打孔,通过热压技术封装构建,详细制作过程参考文献[24]。微芯片通道网络设计如图1a,包括4个通道段,所有通道均宽100 μm,深70 μm;分离通道长2.7 cm,其他3个通道长0.8 cm。微通道雕刻完成后在4个通道端处打孔,乙醇超声洗净后于40 ℃烘干。然后将其置于135 ℃烘箱中热压10 min封装构建微芯片。将5 mL离心管盖打孔后作为储液池,使用由COC溶解到甲苯中制作成的胶水将储液池连接到4个孔处,放置过夜。

图1 (a)芯片电泳、(b)负电荷涂层及(c)正电荷涂层COC表面改性过程的示意图

1.3 表面改性和表征

1.3.1负电荷涂层

COC微通道表面负电荷涂层通过疏水氨基酸吸附、GA固定化、亲水氨基酸功能化构建,如图1b。首先,将2.0%(质量分数)疏水氨基酸/PBS溶液充满通道,室温静置30 min后用蒸馏水冲洗所有通道,38 ℃烘干;其次,将2.25%(v/v)GA水溶液充满通道,室温静置60 min后用蒸馏水冲洗所有通道,38 ℃烘干;最后,将2.5%(质量分数)亲水氨基酸/PBS溶液充满通道,室温静置30 min后用蒸馏水冲洗所有通道,38 ℃烘干制得微芯片,4 ℃保存备用。

通过XPS表征改性COC芯片表面基团。通过接触角测量仪测量接触角研究COC表面亲水性。在具有负电荷涂层COC微通道内充满含有10 mmol/L NBD-F标记氨基酸混合物的0.1 mmol/L硼砂缓冲液(pH 9.3)并静置30 min,用去离子水冲洗5 min后检测,用倒置荧光显微镜拍摄COC微通道照片,使用Image J处理图片得到荧光强度图,通过荧光强度研究COC表面吸附情况。通过SEM表征改性前后微通道表面平整度。

1.3.2正电荷涂层

COC微通道表面正电荷涂层通过Val吸附、EDC/NHS羧基活化、EDA功能化构建,如图1c。首先,将2.0%(质量分数)Val/PBS溶液充满通道,室温静置30 min后用蒸馏水冲洗所有通道,38 ℃烘干;其次,将含有4.0%(质量分数)EDC/NHS的PBS溶液充满通道,室温静置过夜后用蒸馏水冲洗所有通道,38 ℃烘干;最后,将5.0%(质量分数)EDA/PBS溶液充满通道,室温静置5 h后用蒸馏水冲洗所有通道,38 ℃烘干制得微芯片,4 ℃储存备用。动态涂层通过将含有0.015%(质量分数)SDS和0.005%(质量分数)HPMC的0.1 mmol/L硼砂缓冲液引入COC通道自动形成。

通过XPS表征改性COC芯片表面基团,通过接触角测量仪测量接触角研究COC表面亲水性。在COC微通道内充满含有10 mmol/L NBD-F标记Asp与Tau的0.1 mmol/L硼砂缓冲液(pH 5.5),静置30 min,用去离子水冲洗5 min后检测,研究吸附性能。

1.4 MCE实验方法

依次用水和缓冲液冲洗微芯片通道5 min。将样品溶液置于储液池1,将缓冲液先填充到其余储液池中,采用门控进样模式将样品进样到分离通道中。然后在储液池1和2处施加高电压形成稳定样品流;随后,将储液池2处高电压切换到接地,实现样品进样,进样时间为1 s;进样完成后马上在储液池1和2处施加电压(φ),为分离通道提供合适电场,实现电泳分离。或在储液池3和4处施加高电压形成稳定样品流;随后把储液池3处高电压切换到接地,实现样品进样,进样时间1 s;进样完成后马上在储液池3和4处施加高电压,实现电泳分离。

通过LIF检测器[24]检测样品,通过MATLAB和Origin数据分析工具分析得到的电泳图。

1.5 样品制备

儿童保健品:精确称量0.02 g研磨后的儿童保健品,溶解在4.0 mL纯水中,涡旋混合1 min,超声波辅助萃取10 min,萃取液以5 000 r/min转速离心10 min,上清液用0.45 μm膜过滤后,滤液待测。

运动饮料:取1 mL样品用0.45 μm膜过滤后,滤液待测。

标准品衍生化:将100 μL 25 mmol/L NBD-F甲醇溶液分别加入200 μL不同质量浓度的Lys (0.05～122 mg/L)、GABA(0.34～86 mg/L)、Tau(0.40～104 mg/L)及Asp(0.40～111 mg/L)溶液中,80 ℃水浴反应15 min,冷却至室温后,储存在4 ℃备用。

样品衍生化:将10 μL 25 mmol/L NBD-F甲醇溶液加到10 μL待测液中,衍生化方法同上。

1.6 液相色谱方法

保健品中Lys和GABA采用HPLC标准方法[25,26]做对比实验。流动相为0.05 mol/L乙酸钠水溶液-乙腈(75∶25, v/v)。采用C18色谱柱作为分析柱,进样体积10.0 μL,柱温为30 ℃,流速为1.0 mL/min,紫外检测波长为360 nm。

Tau和Asp采用HPLC法[27]做对比实验。流动相为0.05 mol/L磷酸二氢钠水溶液(质量分数为5%的氢氧化钠溶液调节pH至6.5)-乙腈(85∶15,v/v)。采用C18色谱柱作为分析柱,进样体积10.0 μL,柱温为40 ℃。流速为1.0 mL/min,紫外检测波长为360 nm。

2 结果与讨论

2.1 静态表面改性微芯片

2.1.1改性微芯片的性能表征

通过疏水氨基酸(以Val为例)吸附、GA固定化、亲水氨基酸(以Asp为例)功能化在COC通道表面构建Val-GA-Asp 3层静态涂层。通过XPS表征确定其是否成功涂覆在COC表面,并考察了静态涂层改性微芯片表面亲水性和抗吸附性能。

2.1.1.1涂层表征

为确定Val-GA-Asp静态涂层改性COC微芯片表面的元素组成,进行了XPS表征。如图2a, C 1s、N 1s和O 1s的特征峰分别出现在284.8、400.6和532.2 eV处。根据其化学结构,C 1s峰被拟合为3个成分。如图2b, 284.8、285.8和288.0 eV处主要成分分别来自碳碳单键(C-C)、碳氮单键(C-N)以及羧基(O-C=O)中的碳[28], N 1s峰被拟合为1个成分。如图2c, 401.8 eV处主要成分来自C-N=C中的氮[29]。如图2d, O 1s峰被拟合为2个成分。其中531.8 eV和532.8 eV处主要成分分别来自羧基中碳氧单键(C-O)和碳氧双键(C=O)中的氧[28]。除了COC微芯片上有的C-C键外,其余化学键均来自Val-GA-Asp涂层,XPS表征结果证明负电荷涂层成功涂覆在COC芯片上。

图2 (a)静态涂层改性COC表面XPS光谱图, (b)C 1s、(c)N 1s、(d) O 1s峰拟合图,(e)负电荷涂层COC板上接触角, (f)COC微通道中空气-水界面轮廓图以及静态涂层(g)涂覆前和(h)涂覆后COC通道表面对氨基酸的吸附

2.1.1.2亲水性和抗吸附性能表征

采用接触角测量仪测量负电荷涂层涂覆前后COC板的水接触角,研究了COC表面亲水性。如图2e,负电荷涂层改性后,COC表面亲水性提高,水在COC表面上接触角从97.44°变为42.31°。如图2f,除了COC板上接触角减小,负电荷涂层改性后COC微通道中空气-水界面轮廓从直线变为曲线,也证明了其亲水性增强。

为研究负电荷涂层改性后COC通道表面抗氨基酸吸附能力,以0.1 mmol/L硼砂缓冲液作为背景电解质(back-ground electrolyte, BGE),将10 mmol/L NBD-F标记氨基酸混合物充满负电荷涂层改性COC微通道,去离子水冲洗后检测,荧光强度与通道内吸附量成正比,如图2g,未改性COC通道对于氨基酸有较强吸附,通道照片呈现强荧光。如图2h,负电荷涂层可有效避免通道对氨基酸非特异性吸附,改性COC通道内外荧光强度相同。

2.1.2芯片改性用氨基酸的选择

由于氨基酸侧链基团不同,负电荷涂层中第1层涂覆的疏水氨基酸涂层与第3层涂覆的亲水氨基酸涂层可能影响分析物柱效,选用带有最多正电荷的Arg作为模型分析物,研究了不同氨基酸涂层对其柱效的影响。

疏水氨基酸种类可能影响涂覆均匀性,从而影响抗吸附效果和电泳性能。将Trp、Leu、Phe、Met、Ile、Val、Ala和Pro 8种疏水氨基酸分别吸附在COC表面作为静态涂层第1层,通过GA固定化和Lys功能化构建负电荷涂层。以0.1 mmol/L硼砂缓冲液作为BGE,将0.10 mmol/L NBD-F标记Arg进样,以800 V为分离电压,得到不同涂层下的Arg电泳与理论塔板高度(H)图。结果表明,以Val为第1层涂层时,Arg的峰形最好,峰宽最窄(如图3a), Arg的H值有最小值(如图3b),即其涂层均匀性和电泳性能最好,因此选择Val为第1层疏水氨基酸涂层用于后续实验。

为得到好的分离效果,考察了第3层亲水氨基酸种类对Arg峰形与柱效的影响。通过Val吸附、GA固定化后,采用不同的亲水氨基酸作为第3层构建负电荷涂层。以0.1 mmol/L硼砂缓冲液作为BGE,将0.10 mmol/L NBD-F标记Arg进样,以800 V为分离电压,得到不同涂层下Arg电泳与H图。结果表明,在侧链基团含羧基的Asp作为改性第3层涂层时,Arg获得最好的峰形,峰宽最窄(如图3c),H最低(如图3d),柱效好。因此选择Asp为第3层亲水氨基酸涂层用于后续实验。

2.1.3电泳分离条件考察

样品移动速度(u) 考察了不同分离电压对Val-GA-Asp涂层改性通道的COC微芯片中Lys和GABA移动速度的影响。将0.10 mmol/L NBD-F标记Lys和0.50 mmol/L NBD-F标记GABA分别进样,在进样口下游1.5 cm处检测。如图4a, Lys和GABA的u均随分离电压线性增加。在同一分离电压下,Lys的u比GABA大,且Δu随着电压增大而增大,表明负电荷涂层改性微芯片同步MCE分离分析Lys与GABA有可能性。

图4 分离电压φ对(a)u以及(b)H的影响,(c)不同 分离距离和(d)不同分离电压下Lys和GABA的分离度(n=3)

柱效 用Lys和GABA的H与φ的关系表征MCE的分离性能。图4b为φ对COC通道中Lys和GABA迁移的影响。随着φ增大,Lys和GABA的H值先降低后增加,在800 V处取得了最小值。这符合电泳规律,能通过调节φ达到最佳柱效。

分离度(Rs) 将Lys和GABA的混合物进样,在分离通道中检测并计算电泳图中的峰分离度,研究改性芯片的MCE分离性能及分离距离(L)对分离性能的影响。以0.1 mmol/L硼砂缓冲液作为BGE,将0.10 mmol/L NBD-F标记Lys和0.50 mmol/L NBD-F标记GABA混合物进样,分离电压为800 V,在分离通道不同分离距离处检测,获得一系列电泳图。如图4c, Lys和GABA的Rs与L成正比,在L=2.0 cm时获得L最大值2.82。分离电压对分离性能的影响如图4d, Lys和GABA在φ=800 V时获得最大Rs值2.28。因此,选择L=2.0 cm与φ=800 V用于后续实验。在此条件下,每次分离只需40 s即可完成。

2.1.4MCE分析Lys和GABA的方法学考察

在800 V分离电压下,以0.1 mmol/L硼砂缓冲液作为BGE,将NBD-F标记Lys和GABA进样,并在分离通道距离进样口2.0 cm处检测,建立了Lys和GABA的分析方法。结果表明,在0.10～122 mg/L(对应样品中含量为0.10～122 mg/kg)范围内,NBD-F标记Lys的峰面积(A)线性增加,A与分析物含量(c, mg/kg,下同)之间的线性方程为A=5.79×10-3c+2.79×10-4,相关系数(r)为0.999 0; GABA线性方程在1.03～68.7 mg/L(对应样品中含量为1.03～68.7 mg/kg)范围内为A=1.54×10-3c+6.23×10-4,r为0.997 6。Lys和GABA的检出限(LOD)分别为0.03和0.12 mg/kg (S/N=3);测得含量的相对标准偏差(RSD)均小于7.3%(n=5)。

将静态涂层改性COC微芯片的MCE-LIF方法用于儿童保健品中Lys和GABA的分析。加标前后儿童保健品的电泳图如图5, Lys和GABA的测得含量和回收率列于表1中。在儿童保健品中,检测到3.08 mg/kg Lys和2.53 mg/kg GABA, Lys和GABA的回收率分别为104%～118%和84.8%～114%, RSD≤7.2%(n=3)。

表1 儿童保健品中Lys和GABA的分析(n=3)

图5 儿童保健品及3.00 mg/kg加标样品的电泳图

作为参考,儿童保健品也通过HPLC标准法进行了分析,在0.12～12.2 mg/kg范围内,Lys的线性方程为A=7.77×103c-83.1,r为0.999 3; GABA的线性方程在0.09～8.59 mg/kg范围内为A=3.13×104c-1.17×104,r为0.998 7 (n=3)。

由表1可以看出,MCE方法测定结果与HPLC方法测定结果的相对误差分别为0.98%和9.1%。说明该方法对保健品中Lys和GABA的分离分析准确可靠。

2.2 动/静态结合表面改性微芯片

2.2.1改性微芯片的性能表征

根据1.3.2节表面改性方法,通过Val吸附、EDC/NHS羧基活化、EDA功能化在COC通道表面构建Val-EDA静态涂层。通过XPS表征确定静态涂层是否成功涂覆在COC微芯片表面,并考察了改性微芯片的亲水性和抗吸附性能。

涂层表征 为确定Val-EDA静态涂层改性COC微芯片表面的元素组成与表面化学特性,进行XPS表征,如图6a, C 1s、N 1s和O 1s特征峰分别出现在289.9、406.4和537.3 eV处。根据其化学结构,C 1s峰被拟合为2个成分,如图6b, 284.8和285.8 eV处主要成分分别来自碳碳单键(C-C)和碳氮单键(C-N)中的碳[28]。N 1s峰被拟合为2个成分,如图6c, 399.6 eV和400.5 eV处主要成分分别来自氨基(NH2)和碳氮单键(C-NH-C)中的氮[28]。如图6d, O 1s峰被拟合为1个成分,在532.2 eV处主要成分来自碳氧双键(C=O)中的氧[28,30]。除了COC微芯片上有的C-C键外,其余化学键均来自Val-EDA涂层,证明正电荷涂层成功涂覆在COC芯片上。

图6 静态涂层改性COC表面(a)XPS光谱图和(b)C 1s、(c)N 1s、(d)O 1s峰拟合图,(e)正电荷涂层COC板上接触角和(f)COC微通道中空气-水界面轮廓,静电涂层(g)涂覆前和(h)涂覆后COC通道表面对Asp和Tau的吸附

亲水性和抗吸附性能表征 如图6e,正电荷涂层改性后,COC表面亲水性提高,水在COC表面上接触角从98.10°降到54.74°。如图6f,除了COC板上接触角减小,正电荷涂层改性后COC微通道中空气-水界面轮廓从直线变为曲线,也证明了其亲水性增强。为研究正电荷涂层改性COC微芯片通道表面抗吸附能力,以0.1 mmol/L硼砂缓冲液作为BGE,将10 mmol/L NBD-F标记Asp和Tau混合物充满正电荷涂层改性COC微通道,荧光强度与通道内目标物吸附量成正比,如图6g,未改性COC通道由于对Asp和Tau有较强吸附,通道照片呈现强荧光。如图6h,正电荷涂层可有效避免通道对Asp和Tau非特异性吸附,改性COC通道内外荧光强度相同。

2.2.2电泳分离条件考察

动态涂层改性剂浓度影响 为提高Asp和Tau的分离度,使用不带电荷的HPMC与带负电荷的SDS混合体系作为动态涂层,考察了HPMC与SDS质量分数对Asp和Tau的峰展宽(σ)的平方(σ2)与u的影响。以含有不同质量分数HPMC与SDS的0.1 mmol/L硼砂缓冲液作为BGE,将0.10 mmol/L NBD-F标记Asp和0.05 mmol/L NBD-F标记Tau混合物进样并检测。HPMC的质量分数为0.005%～0.015%, SDS的质量分数为0.005%～0.020%,硼砂浓度固定为0.1 mmol/L。如图7a, Asp的u随着HPMC与SDS的质量分数增加而降低,如图7b, Tau的u随着SDS质量分数增加先降低后增加,在0.015% SDS处取得最小值。当SDS质量分数固定为0.015%时,Tau的u随HPMC质量分数增加无明显变化。如图7c与7d, 当HPMC的质量分数固定为0.005%时,Asp与Tau的σ2随SDS质量分数增加先减小后增大,在0.015% SDS处取得最小值。当SDS的质量分数固定为0.015%时,Asp的σ2随着HPMC的质量分数增加而增加,而Tau的σ2随HPMC含量增加先增加后降低,在0.005% HPMC处取得最小值。在0.005% HPMC和0.015% SDS混合体系处有最小的σ2。为得到最优分离度,将0.005% HPMC以及0.015% SDS混合体系用于后续实验。

样品移动速度 以含有0.005% HPMC与0.015% SDS混合体系的0.1 mmol/L硼砂缓冲液作为BGE,将0.10 mmol/L NBD-F标记Asp和0.05 mmol/L NBD-F标记Tau分别进样到仅动态涂层、仅静态涂层以及动/静态涂层结合的分离通道中,采用LIF检测。如图8a,在涂覆有各种表面涂层的分离通道中,Asp与Tau的u均随分离电压线性增加。在同一分离电压下,仅正电荷静态涂层通道中Asp的u最大,仅动态涂层COC通道中Asp的u最小,具有动/静态涂层结合的通道中Asp的u居中。如图8b, Tau的u受各种通道表面涂层模式的影响与Asp趋势类似。在相同条件下,Asp的u比Tau的大,表明改性微芯片对Asp和Tau进行MCE分离分析有可能性。

图8 φ对(a)Asp和(b)Tau u的影响及φ对(c)Asp和(d)Tau H的影响(n=3)

柱效 静态涂层与动态涂层对柱效的影响会显著影响MCE分离性能。用Asp和Tau的H与φ的关系表征MCE性能。φ对具有不同表面涂层COC通道中Asp的影响如图8c,在所有分离电压下,随φ增大,Asp的H值先降低后增加,仅动态涂层中Asp的H值最大,而动/静态涂层中H值最小。如图8d, Tau的H受各种通道表面涂层模式的影响与Asp类似。动态涂层与静态涂层均对MCE柱效提高有影响,动/静态涂层结合改性通道的COC微芯片有最佳柱效。

分离度 将BGE中0.10 mmol/L NBD-F标记Asp和0.05 mmol/L NBD-F标记Tau混合物引入具有不同涂层模式的COC微通道中,以800 V为分离电压,考察不同涂层模式对Asp和Tau分离度的影响。如图9a,仅动态涂层的芯片中Asp和Tau的流速较慢但峰展宽较大,有一定的分离效果。在仅静态涂层的芯片中Asp和Tau的流速较快,有一定的分离现象。在相同条件下,动/静态涂层结合芯片加快了Asp和Tau的移动速度,减小了峰展宽,实现了Asp和Tau的完全分离,有最好的分离性能。将动/静态涂层结合改性微芯片用于后续分析,将Asp和Tau混合物进样,研究分离距离与电场强度对Asp和Tau分离度的影响。以含有0.005%(质量分数)HPMC以及0.015%(质量分数)SDS的0.1 mmol/L硼砂缓冲液作为BGE,将0.10 mmol/L NBD-F标记Asp和0.05 mmol/L NBD-F标记Tau混合物进样,分离电压设置为800 V,在不同分离距离处检测。随着分离距离增加,Asp和Tau的Rs先增加后降低,在1.5 cm处取得Rs最大值(如图9b)。研究了电场强度对Rs的影响。如图9c, Asp和Tau在800 V分离电压下获得了最大Rs值2.59。将1.5 cm分离距离与800 V分离电压用于后续分析,在此优化条件下,每次分离只需60 s即可完成。

图9 (a)涂层类型对Asp和Tau分离的影响和(b)不同分离距离、(c)不同分离电压下测得的Asp和Tau的分离度

2.2.3MCE分析Asp和Tau的方法学考察

在800 V分离电压下,以含有0.005%(质量分数)HPMC和0.015%(质量分数)SDS的0.1 mmol/L硼砂缓冲液作为BGE,将NBD-F标记Asp和Tau进样,建立Asp和Tau分析方法。结果表明,在1.33～111 mg/L(对应样品中含量为1.33～111 mg/kg)范围内,NBD-F标记Asp的峰面积线性增加,线性方程为A=7.25×10-5c+5.38×10-4,r为0.996 8; Tau的线性方程在0.42～20.9 mg/kg范围内为A=7.39×10-4c+5.48×10-4,r为0.998 6;在20.9～104 mg/L(对应样品中含量20.9～104 mg/kg)范围为A=6.28×10-4c+3.09×10-3,r为0.998 9。Asp和Tau的LOD分别为0.35和0.09 mg/kg, 测得含量的RSD均小于5.6% (n=5)。

将具有动/静态涂层结合改性通道的MCE-LIF方法用于运动饮料中Asp和Tau的分析。加标前后运动饮料电泳图如图10。Asp和Tau测得含量和回收率列于表2中。在运动饮料中,检测到(9.89±0.55) mg/kg Asp和(15.9±0.8) mg/kg Tau, Asp和Tau的回收率分别为97.5%～105%和101%～118%, RSD≤6.4%(n=3)。作为参考,通过HPLC方法分析运动饮料,在0.13～13.3 mg/kg范围内,Asp的线性方程为A=1.41×104c-2.03×102,r为0.999 6; Tau的线性方程在0.12～12.2 mg/kg范围内为A=8.12×103c+3.06×102,r为0.999 9。表2中,MCE方法与HPLC方法测定结果的相对误差分别为1.4%和9.4%。表明该方法在保健品天冬氨酸和牛磺酸分离分析中准确可靠。

表2 运动饮料中Asp和Tau的分析(n=3)

图10 运动饮料及8.00 mg/kg加标样品的电泳图

3 结论

本文建立了表面改性微芯片电泳分离检测保健品中功效成分的方法,采用负电荷涂层的COC通道实现了Lys和GABA的分离,Rs为2.82,正电荷涂层的COC通道实现了Asp与Tau的分离,Rs为2.59。将该方法用于保健品中氨基酸的测定,回收率为84.8%～118%, RSD≤7.2%。分析结果与HPLC方法测定结果一致,该方法具有良好的应用前景,适用于儿童保健品中Lys和GABA以及运动饮料中Asp和Tau的检测。