microRNAs与神经母细胞瘤

尹萌萌 刘爱国

神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是一种恶性胚胎性肿瘤,起源于周围交感神经节,30%发生在肾上腺髓质内,70%发生在脊髓、颈部、胸部、腹部或骨盆神经组织内,常见于婴儿和5岁以下儿童[1]。NB以血液转移为特点,预后欠佳,总体生存率仅有40%,高危型患儿5年生存率<10%,10年生存率<2%,占儿童癌症总病死率的10%～15%[2]。NB具有高度异质性,遗传物质在克隆中不断获得突变,从而导致肿瘤进展及耐药等。

microRNAs(miRNAs)是一组长度为19～22个核苷酸的小非编码RNA,可在转录水平上同时调控多个基因表达。研究已发现2000余种miRNAs的生物功能,可调控60%的人类蛋白质编码基因,影响细胞的分化、凋亡。miRNAs功能失调(上调/抑制)会导致肿瘤细胞发生、侵袭、转移或耐药等[3]。因此,miRNAs在肿瘤诊断、预后和治疗方面具有巨大的影响力。

早期神经嵴发育组织中富含多类miRNAs,在神经嵴细胞(neural crest cells,NCCs)内发挥其作用。在发育过程中,miRNAs微调蛋白水平,有助于调节NCCs的诱导、分化和迁移,以及交感肾上腺系上皮细胞向间充质细胞转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)。EMT失调在NCCs异常分化为NB的过程中发挥关键作用。NB的临床特点与遗传物质改变密切相关。例如,研究发现一组肿瘤生长/抑制因子(LET-7、miRNA-101、miRNA-202、miRNA-9、miRNA-34a、miRNA-340、miRNA-184和miRNA-335)在NB的发生过程中会发生一系列表观遗传学改变(异常DNA甲基化或组蛋白修饰)[4]。根据miRNAs对NB的作用分为致癌性miRNAs(oncomiRNAs),转移相关性miRNAs(metastamiRNAs)和抑癌性miRNAs(TSmiRNAs),详见表1[5]。

一、miRNAs对NB发生、侵袭、转移的促进作用

oncomiRNAs和metastamiRNAs在NB发生、进展及转移方面起到重要的驱动作用。例如,oncomiRNA-558可以通过促进乙酰肝素酶、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因的反式激活和蛋白翻译,刺激AGO2和eIF4E蛋白依赖的HIF-2α表达,促进NB生长、侵袭和转移。同样,miRNA-451也通过抑制巨噬细胞分泌抑制因子,促进NB的生长和浸润[6]。miRNA-1303通过靶向作用糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)和SFRP1蛋白,影响cyclinD1的磷酸化过程,抑制WNT/β-catenin信号通路,增强NB细胞的增殖能力。此外,oncomiR-380-3p可通过抑制p53促进肿瘤生长。miRNA-92a-3p则通过靶向抑制PTEN mRNA表达降低PTEN蛋白,促进NB细胞增殖、侵袭和迁移。而miR-195是通过作用RET原癌基因调节NB细胞的侵袭[1]。

长链非编码RNA肿瘤易感基因11(lncRNA CASC11)过度表达在各种肿瘤中,其高水平表达与NB患儿的生存率呈负相关,对NB细胞增殖的促进作用与miRNA-676-3p和NOL4L(nucleolar protein 4 like)有关。三者通过相互促进及拮抗的作用,最终促进肿瘤细胞的增殖和侵袭性[7]。miRNA- 29a/b和miRNA-10b在转移性NB组织中的水平明显高于非转移性组织,证明其对肿瘤迁移的促进作用。

二、miRNAs对NB的抑制作用

miRNA-34a作为首个被发现对NB具有抑制功能的miRNA,位于染色体1p36区域,受抑癌基因TP53调控,特异性作用于HNF4α,并诱导半胱氨酸蛋白酶参与NB细胞的凋亡过程[8]。有研究报道,miRNA-337-3p和miRNA-338-3p可分别通过抑制MMP-14(matrix metalloproteinase-14)和MMP-2转录,诱导NB细胞凋亡[9]。在NB小鼠模型中,miRNA-542-5p和miRNA-497的过度表达可抑制肿瘤生长,而miRNA-709通过与H3K27me3和AGO1(argonaute-1)结合形成复合物,抑制NB相关蛋白转录及转录后的表观遗传学改变。HOXA7活跃在多种肿瘤细胞内,包括NB。而将HOXA7作为作用靶点的miRNA-144-3p,可直接抑制NB细胞[10]。在TSKU蛋白的调节下,miRNA-2110可诱导神经细胞生长,对NB细胞具有诱导分化及抑制的作用[11]。

miRNA-449a对多种肿瘤都具有抑制功能,包括NB,其通过靶向作用PKP4、MDM4、TSEN15和MFAP4,诱导NB细胞分化,同时下调CDK6癌基因表达和淋巴增强因子1水平,阻滞细胞周期,加速肿瘤细胞凋亡[12, 13]。与miRNA-449a相似,miRNA-323-5p和miRNA-342-5p可通过直接作用CCND1、CHAF1A、INCENP和Bcl-Xl基因,抑制NB细胞生长。其他miRNAs,如miRNA-145、miRNA -27b、miRNA-1247、miRNA-146a、miRNA-542-3p和5p也是通过影响原癌基因、细胞因子或蛋白,抑制肿瘤生成[14,15]。

转录调节因子LMO1已被证明有促癌作用,并经过全基因组关联检测确定为NB易感基因。至少有18种具有抑癌作用的miRNAs受LMO1抑制,包括Let7家族(7a-5p、7b-5p、7c、7e-5p、7f-5p、7g-5p和7i-5p)[16]。某些特殊的miRNAs,如miRNA-138,在正常情况下对肿瘤无影响,但与黄酮类化合物如芹菜素结合后,会对NB细胞发挥明显的抑制功能[17]。

三、MYCN与miRNAs的相互作用

NB的发生和发展与交感神经元和肾上腺髓质发育机制的破坏密切相关,MYCN和Trk家族基因的改变已被证明与NB的发生进展密切相关,间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)则与家族性NB相关。其中,MYCN扩增是NB最常见及最重要的遗传物质改变,是NB最关键的基因,其高水平表达与细胞的异常增殖及侵袭性有关。MYCN作为一种转录因子及表观遗传调控因子,对发育中组织的基因表达调控及正常的神经发育至关重要,可维持细胞的多能性,促进细胞增殖或细胞周期进程[18]。

MYCN与miRNAs在生物学功能上相互影响,miRNAs可调控N-Myc表达,而MYCN也可上调或下调miRNAs的表达,前者包括miRNA-1206、miRNA-548a-5p、miRNA-548f、miRNA-639、miRNA-640、miRNA-641、miRNA-647、miRNA-662、miRNA-886-3p、miRNA-887、miRNA-576-5p和miRNA-600,后者包括miRNA-513a-5p、miRNA-198、miRNA-1280、miRNA-1308、miRNA-1908、miRNA-513b、miRNA-548f、miRNA-1261、miRNA-1268、miRNA-363和miRNA-183。此类miRNAs可预测NB患儿的预后。比如, miRNA-363和miRNA-183被MYCN抑制后,ROCK、LRGR1和MAPK1会增强癌细胞的迁移,若两者过度表达,则预示预后良好[19]。

与无MYCN扩增的NB比较,扩增组织中有多种miRNAs的水平存在明显差异。比如,可诱导细胞凋亡的miRNA-323a-5p和miRNA-342-5p在有MYCN扩增的NB中,表达水平明显下降[15]。同样,通过抑制MYCN、AURKA、TGFBR1和TGFBR2,阻止肿瘤迁移的miRNA-186,以及可降低原癌基因水平的miRNA-15a-5p、miRNA-15b-5p、miRNA-16-5p,在MYCN高度表达的NB细胞中,表达明显降低[20]。

MYCN与miRNAs的相互作用也表现在信号通路上,比如PI3K/Akt/mTOR信号通路可刺激NB细胞增殖、耐药等,而miRNA-184通过结合Akt mRNA的3′UTR,抑制Akt对MYCN的刺激作用,降低N-Myc水平和肿瘤生长速度。此外,miRNA-335通过抑制TGF-β信号通路活化蛋白激酶1和Rho相关螺旋蛋白,抑制NB细胞的侵袭和迁移潜能,但MYCN可通过直接下调miRNA-335来抵消这种作用。被N-Myc调控的miRNAs,大都与不良预后有关,包括miRNA-25、miRNA-17、miRNA-18、miRNA-19、miRNA-20a、miRNA-143和miRNA-27等。其中,miRNA-181a/b可直接增强ABL1表达,而ABL1的表达水平与MYCN拷贝数呈正相关[21]。

四、miRNAs对NB耐药的作用

耐药会导致90%以上的化疗失败。研究表明,N-MYC可直接或间接参与某些miRNAs的分化调节过程,包括miRNA-17-5p、miRNA-18a、miRNA-19a、miRNA-20a和miRNA-92,介导NB耐药发生[1]。此外,miRNA-21结合PTEN后也会导致NB对顺铂耐药[22]。miRNA-15a/16-1的获得性丢失可诱导BMI1癌蛋白表达和谷胱甘肽依赖反应激活,导致NB对依托泊苷耐受。在一项关于NB对顺铂、依托泊苷交叉耐药的研究中发现,染色体重排及miRNA-520f的丢失会增加细胞神经凋亡抑制蛋白生成,导致肿瘤耐药。在对阿霉素耐药的NB细胞中,miRNA-137被选择性下调,而miRNA-137表达增强会抑制雄甾烷受体蛋白,促进NB对阿霉素的敏感度。miRNA-497可针对性作用耐药调节剂WEE1激酶,其丢失不仅明显降低NB患儿的生存率,还会减弱NB对顺铂的敏感度。NB细胞与邻近单核细胞之间的miRNAs旁分泌交换,如miRNA-16、miRNA-125b、miRNA-21、miRNA-23a、miRNA-24、miRNA-25、miRNA-27b、miRNA-218、miRNA-320a和miRNA-92a,可作用于NFKB、STAT3、p53、TLR8等基因,诱导NB细胞突变,抵抗化疗药物毒性[23]。

除耐药外,miRNAs也可增强肿瘤对化疗的敏感度。比如,加强miRNA-149对CDC42和Bcl-2表达的调节,及miR-204靶向作用的Bcl-2和NTRK2获得性丢失,可分别增加NB细胞对阿霉素和顺铂的敏感度[24]。MiRNA-34a不仅可以靶向作用MYCN,还可针对性作用耐药过程中的关键参与者,包括E2F3、Bcl-2、CCND1和CDK6,有助于减弱NB的耐药性。而miRNA-129,不仅可以通过下调MYO10抑制肿瘤,还能增强环磷酰胺对NB细胞的杀伤能力[25]。

五、miRNAs与NB治疗

肿瘤切除并辅以化疗是Ⅰ/Ⅱ期NB患儿的主要治疗方法,Ⅲ/Ⅳ期患儿的治疗则需要在手术和高强度化疗后,再辅以放疗和干细胞移植。治疗效果欠佳的患儿后期甚至需要维甲酸类药物或免疫抑制剂治疗。虽然NB的治疗方法有多种,但高危型患儿的整体生存率仍低。而且,传统的化疗药物也存在一些不足,比如溶解度差、生物利用度低、半衰期短和特异性差等。化疗药物无法足量到达肿瘤组织,不仅会减弱治疗效果,还会促使肿瘤耐药[26]。

目前认为化疗联合miRNAs的靶向治疗,是对NB患儿更有效的一种治疗策略,其作用机制是利用反义寡核苷酸阻断oncomiRNAs的表达,并增强TSmiRNAs表达。抗体-抗原(配体-受体)原理允许纳米颗粒与配体偶联,携带miRNAs与肿瘤细胞表面抗原靶向结合,提高治疗的特异性。双唾液酸神经节苷脂GD2抗原在NB细胞表面表达较多,为miRNAs治疗提供了治疗靶点。使用GD2包覆的纳米粒子将miRNA-34a、miRNA-429或miRNA-542-3p导入人体与NB细胞结合,可促进肿瘤细胞凋亡[27]。其他TSmiRNAs,如miRNA-9、miRNA-27b、miRNA-34a、miRNA-145、miRNA-184等也可尝试与纳米颗粒结合,实现精准治疗[17]。

维甲酸(retinoic acid,RA)目前作为NB的治疗药物,在调节N-MYC的同时也会影响miRNAs的表达。受RA诱导而生长停滞的NB细胞中,已发现有14种miRNAs(miRNA-9、miRNA-124a、miRNA-125a、miRNA-125b、let-7a、let-7b、miRNA-7、miRNA-22a、miRNA-24、miRNA-26a、miRNA-30a-5p、miRNA-100和miRNA-103)的表达水平会明显下降,而抑制肿瘤生长的miRNA-128和miRNA-340,表达水平会明显上升[28]。

Semliki森林病毒(semliki forest virus,SFV)属于RNA 病毒,具有较强的扩增和肿瘤杀伤能力,是针对NB的一种强免疫治疗剂。有研究发现在SFV-4病毒中插入miRNA-124、miRNA-125和miRNA-134,可提高肿瘤的溶解能力,并降低药物的神经毒性。同样,肠道病毒EV71可通过刺激miRNA-LET-7b,对耐药型NB具有较好的治疗效果。而5-羟色胺抑制剂氟西汀,治疗NB的机制是可持续上调NB细胞中miRNA-572和miRNA-663A的表达,并抑制肿瘤相关癌基因及生长因子(CDKN1、TGF-β1、Dicer1、Wnt7a、PTEN、VEGFA)的功能[29]。

新化疗药物的开发也为NB的治疗带来福音。比如,研究发现蒽酰胺-吡唑啉1,5-α嘧啶可上调miRNA-34-a、miRNA-34-c、miRNA-200b、miRNA-107、miRNA-542-5p和miRNA-605的表达,激活p21和Bax基因,促使NB细胞凋亡。而白藜芦醇等天然植物黄素可通过诱导miRNA-137,抑制蛋白质组蛋白甲基转移酶,消灭NB细胞[1]。

miRNAs作为基因调控因子,不仅存在细胞内,在血清、血浆、唾液和尿液等体液中也可检测到,而且体液中miRNAs的成分及水平变化与包括癌症在内的多种疾病密切相关,临床上可考虑将miRNAs 作为一种无创生物学标志物,用于评估和监测NB患儿的病情进展[3]。

六、展 望

尽管在过去的20多年里,多学科综合治疗在临床中做出了巨大努力,但高危型NB患儿的治疗效果欠佳,5年生存率不到10%,主要原因是NB细胞遗传物质的持续改变,决定了肿瘤的进展和耐药性。因此,临床急需发现新的治疗策略。在过去的10年中,分子生物学研究得到了适当的关注,提出了许多治疗靶点,包括miRNAs。miRNAs是一类新型基因调节因子,研究证明其在NB的发生和进展中起到至关重要的作用,这些发现不仅为NB的分子发生机制提供新的见解,也提高了miRNAs在NB诊断、预后和治疗中的应用可能性。比如,临床已尝试针对TSmiRNAs和oncomiRNAs的靶向治疗,虽然将这些研究数据应用到临床中尚处于起步阶段,但这些发现将为NB的治疗提供强有力的基础,并确定miRNAs在NB治疗中的作用。总之,大量的研究证据支持miRNAs在对抗NB进展及化疗耐药性中的巨大临床潜力,值得在该领域中开展进一步研究。