重组破伤风毒素重链片段C蛋白原核表达条件的优化

官月婵，马鑫宇，肖红剑，王东宝，王学付，李娇春，谭银珍，李智华，寸韡

中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所，云南昆明650118

破伤风（tetanus）是破伤风梭菌经由皮肤或黏膜伤口侵入人体，在缺氧环境下生长繁殖，产生破伤风神经毒素（tetanus neurotoxin，TT）而引起肌痉挛的一种特异性感染。TT 主要侵袭神经系统中的运动神经元［1-2］。破伤风是一种急性、致命性传染病和神经系统疾病，病死率高达40%［3］。

经典的破伤风疫苗是由TT 经甲醛灭活后获得无毒性的TT 制备，破伤风梭菌可形成抵抗力强大的芽孢，且TT 毒力较强，制备工艺较为严苛，同时甲醛处理类毒素还容易形成环境污染，因此现有工艺具有进一步改进的空间。

通过基因重组的方式表达突变的无毒性毒素蛋白或毒素片段，可省却复杂的灭活过程，同时保留毒素蛋白的免疫原性。TT 由1 条相对分子质量约150 000 的单一多肽链构成，随后多肽链可被切成2 条由单一二硫键连接的重链和轻链组成AB 型毒素，轻链具有蛋白酶功能，而重链负责受体结合，单独的2 条肽链均无毒性，但其作为抗原诱导产生的抗体可有效中和TT。前期实验结果显示，TT 重链片段C（tetanus toxin heavy chain C-fragment，TTHc）相对分子质量约50 000，负责神经痉挛结合和逆行传输［4-5］，其结构稳定，表达量较高，具有诱导抗毒素中和抗体的能力［6］。因此，重组亚单位疫苗成为一种更加安全有效的替代疫苗。TTHc 保留了许多特性［4，7］，是开发破伤风人用疫苗的一个很有前途的候选分子。

为了筛选高效表达重组TTHc（rTTHc）的原核表达系统，使目的蛋白在大肠埃希菌中获得高表达的可溶性产物，本研究采用3种原核表达载体在不同温度条件下对rTTHc 进行了表达，以表达量及可溶性为检测指标，确定最适表达载体及其最佳诱导条件。

1 材料与方法

1.1菌株、载体及基因 感受态大肠埃希菌BL21（DE3）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；pET30a、pBV220、pColdⅡ载体保存于中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所寸韡实验室；密码子优化后的rTTHc基因片段（1 359 bp）由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2主要试剂及仪器 限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、NdeⅠ等购自NEB（北京）公司；T4 DNA 连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司；2×GoldStar Best Master Mix（Dye）购自北京康为世纪科技有限公司；通用性DNA 纯化试剂盒、琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；Biosafer 细胞破碎机购自赛飞（中国）有限公司；AKTAexplorer 100 蛋白分析仪购自美国GE 公司；HPLC色谱仪购自安捷伦科技有限公司；G3000SWXL 色谱柱购自日本TOSOH。

1.3重组表达质粒的构建 以rTTHc基因合成片段为模板，按照2×GoldStar Best Master Mix（Dye）标准条件进行PCR扩增，扩增产物和pET30a载体经NdeⅠ和BamHⅠ双酶切处理后，将基因片段和载体经T4 DNA 连接酶16 ℃水浴连接10 h，构建原核表达质粒pET30a-rTTHc。以rTTHc基因合成片段为模板，按照2×GoldStar Best Master Mix（Dye）标准条件进行PCR扩增，扩增产物和pBV220 载体经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切处理后，将基因片段和载体经T4 DNA 连接酶16 ℃水浴连接10 h，构建原核表达质粒pBV220-rTTHc。以rTTHc基因合成片段为模板，按照2×Gold-Star Best Master Mix（Dye）标准条件进行PCR 扩增，扩增产物和pColdⅡ载体经NdeⅠ和BamHⅠ双酶切处理后，将基因片段和载体经T4 DNA 连接酶16 ℃水浴连接10 h，构建重组质粒pCold-rTTHc。将3 种表达质粒分别转化大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞中，37 ℃平板培养过夜，提取质粒，pET30a-rTTHc和pCold-rTTHc进行NdeⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，pBV220-rTTHc进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定。鉴定正确的质粒送北京擎科生物技术有限公司测序。

1.4重组质粒的诱导表达

1.4.1培养基配制 LB培养基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，调pH为7.0后定容到1 L，经121 ℃，20 min高压灭菌后使用。质粒pBV220-rTTHc和pColdrTTHc所用培养基加入氨苄青霉素至100 µg／mL，质粒pET30a-rTTHc所用培养基加入卡那霉素至50 µg／mL。

1.4.2质粒pET30a-rTTHc的表达 将pET30a-rTTHc甘油菌以划线的方式涂布LB 固体培养基中，37 ℃培养过夜；挑取单菌落至3 mL LB 培养基（含卡那霉素100 mg／mL）管中，37 ℃振荡培养6 h；按1%接种量接种至30 mL LB 培养基中，振荡培养至A600达0.4 ～0. 6 时，加入2 mg／mL IPTG，37 ℃诱导4 h；收集菌液，13 500 ×g离心2 min，弃上清，每1 mL 沉淀中加入1 mL PBS缓冲液重悬，冰浴条件下超声破碎菌体，至菌悬液澄清；将超声后裂解液13 500×g离心5 min，收集上清，保存至新的离心管中，再用PBS 缓冲液洗涤沉淀2 次，每1 mL 沉淀以0. 5 mL PBS 缓冲液重悬。收集未诱导全菌蛋白以及诱导后全菌蛋白、诱导后全菌液超声后上清和沉淀，分别进行非还原10%SDS-PAGE分析。

1.4.3质粒pBV220-rTTHc的表达 挑取单菌落接种至LB 培养基（含氨苄青霉素50 mg／mL），无需IPTG诱导表达，直接升温至42 ℃，诱导4 h。具体步骤同1.4.2项。

1.4.4质粒pCold-rTTHc的表达 挑取单菌落接种至LB 培养基（含氨苄青霉素50 mg／mL），A600达0. 4 ～0. 6 时，15 ℃静置30 min 后再加入2 mg／mL IPTG，随后振荡诱导培养8 h，诱导温度为15 ℃。具体步骤同1.4.2项。

1. 5质粒pET30a-rTTHc诱导表达条件的优化 在其他条件不变的情况下，将诱导温度从37 ℃降至28 ℃诱导4 h。具体步骤同1.4.2项。

1.6目的蛋白的纯化 收集28 ℃2 mg／mL IPTG诱导表达4 h的pET30a-rTTHc菌液1 L，经13 500×g离心5 min，弃上清，PBS 重悬菌体沉淀，用ATS 细胞专用破碎机以55 Mpa压力将菌液破碎3次，再经9 000×g离心20 min，收集上清，用AKTAexplorer 100 蛋白分析仪进行纯化，纯化产物进行非还原10%SDS-PAGE及HPLC分析。

2 结果

2.1rTTHc基因片段的鉴定 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见1 365 bp 的目的基因片段，见图1。

图1 rTTHc基因片段PCR扩增产物电泳图Fig. 1 Electrophoretic profile of PCR product of rTTHc gene fragment

2.2重组质粒的鉴定 质粒pET30a-rTTHc的双酶切（NdeⅠ／XhoⅠ）产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见5 230 bp的载体片段和1 404 bp的目的基因片段，大小与预期相符，测序结果与设计的目标序列完全一致，表明重组表达质粒构建成功。质粒pBV220-rTTHc的双酶切（EcoRⅠ／BamHⅠ）产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见3 656 bp 的载体片段和1 365 bp的目的基因片段，大小与预期相符，测序结果与设计的目标序列完全一致，表明重组表达质粒构建成功。质粒pCold-rTTHc的双酶切（NdeⅠ／XhoⅠ）产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见5 341 bp 的载体片段和1 391 bp 的目的基因片段，大小与预期相符，测序结果与设计的目标序列完全一致，表明重组表达质粒构建成功。见图2和图3。

图2 质粒pET30a-rTTHc（A）、pBV220-rTTHc（B）和pColdrTTHc（C）的双酶切鉴定Fig.2RestrictionmapofrecombinantplasmidspET30a-rTTHc（A），pBV220-rTTHc（B）and pCold-rTTHc（C）

图3 质粒pET30a-rTTHc（A）、pBV220-rTTHc（B）和pColdrTTHc（C）构建图谱示意图Fig. 3 Construction of plasmids pET30a-rTTHc（A），pBV220-rTTHc（B）and pCold-rTTHc（C）

2. 3rTTHc蛋白表达产物的鉴定 10%SDS-PAGE分析显示，质粒pET30a-rTTHc和pBV220-rTTHc在IPTG诱导后4 h 即可达到表达峰值，而pCold-rTTHc在IPTG诱导后8 h才达到表达峰值。见图4。

图4 rTTHc蛋白表达的SDS-PAGE鉴定Fig.4 SDS-PAGE profile of expressed rTTHc

2.4rTTHc蛋白的可溶性表达分析 10%SDS-PAGE分析显示，pET30a-rTTHc诱导4 h 和pCold-rTTHc诱导8 h 后表达的目的蛋白大部分存在于菌裂解液上清中，少量存在于沉淀中，但pET30a-rTTHc的可溶性表达量略低于pCold-rTTHc；pBV220-rTTHc诱导4 h后表达的目的蛋白量较少，可溶性也较低。见图5和图6。

图5 rTTHc蛋白可溶性表达的SDS-PAGE分析Fig.5 Analysis of solubility of rTTHc by SDS-PAGE

图6 rTTHc蛋白可溶性表达的比较Fig.6 Comparison of soluble expression of rTTHc protein

2. 5质粒pET30a-rTTHc的最佳诱导表达条件 10%SDS-PAGE 分析显示，在蛋白表达量保持不变的情况下，28 ℃诱导的可溶性表达较37 ℃有所提高。见图7和图8。

图7 两种温度条件下rTTHc蛋白可溶性表达的SDS-PAGE分析Fig. 7 SDS-PAGE profile of rTTHc protein expressed in a soluble form at two temperatures

图8 两种温度条件下rTTHc蛋白可溶性表达的比较Fig. 8 Comparison of soluble expression of rTTHc protein at two temperatures

2.6纯化的rTTHc蛋白的纯度 10%SDS-PAGE分析显示，rTTHc 蛋白条带单一，纯度较好，见图9；经HPLC 分析其纯度可达97%，见图10。表明该诱导条件可用于后续实验。

图9 纯化后rTTHc蛋白的SDS-PAGE分析Fig.9 SDS-PAGE profile of purified rTTHc protein

图10 纯化后rTTHc蛋白的HPLC色谱图Fig.10 HPLC profile of purified rTTHc protein

3 讨论

TT 作为致死率极高的一种细菌蛋白质，其中和性抗体及疫苗研发一直备受关注。虽然TT 在其中和毒性作用及主动免疫中有较好表现［8］，但其脱毒工艺复杂，使用实验动物制备中和性抗体具有多种不稳定性，易产生过敏反应［9-10］，且破伤风梭菌制备TT 的培养条件苛刻［11］，对厂房要求较高，增加了疫苗生产成本，因此，需要研发更优的疫苗种类及其制备方式［12-13］。TT 由相对分子质量约150 000 的3 个片段组成，C-端结构域是TT与神经节苷脂结合部位，是具有重要功能的活性部位［14］。TT 的C 端结构域不仅具有较高的免疫原性，安全性也较好，并且TT可被针对C-端的单抗中和，因此，rTTHc 蛋白的表达及免疫效果可为基因工程疫苗的研发提供参考［15-16］。1980 年，白喉类毒素共价结合b 型流感杆菌荚膜多糖（Hib）的疫苗就取得了可观的免疫效果［17］。因此rTTHc也可作为结合疫苗的载体蛋白使用［18］。

本研究将rTTHc片段基因克隆至3 种不同载体上，成功构建了不同温度条件下诱导表达的原核表达载体，最终获得较多的可溶性表达，以利于纯化及后期的免疫实验。本文对不同条件下的原核表达进行了优化，以期找到最合适的表达系统。结果显示，不同的载体表达效果也不同。对于pBV220 这类启动子的工程菌，热诱导程序对提高外源蛋白的表达至关重要［19］，适合用于大规模表达。但其与pET30a和pColdⅡ载体相比，在rTTHc 蛋白的表达上不具优势。pColdⅡ是一种冷休克表达载体，带有大肠埃希菌冷休克基因CspA 启动子序列，并在CspA 启动子下游插入了乳糖操纵子lac operator，可严格调控目的基因表达。15 ℃低温诱导使大肠埃希菌自身的蛋白质合成受到抑制，从而使目的蛋白获得高效表达。本实验中，pCold-rTTHc在表达量上与pET30a-rTTHc相当，但可溶性表达上略高于pET30a-rTTHc，而pColdrTTHc需在低温表达且表达饱和时间较长，因此不太适于大量基因工程产品的生产需求。

pET30a-rTTHc在所有表达载体中的表达量和表达效率均较高，但可溶性表达略低于pCold-rTTHc。高可溶性蛋白利于高效纯化和生产，pColdⅡ使rTTHc蛋白高可溶性表达的优势可能在于蛋白低温时的缓慢释放。因此，本研究将pET30a-rTTHc在28 ℃室温进行诱导表达，结果显示，该诱导温度下，不仅保留了蛋白表达量，还提高了蛋白的可溶性表达。

综上所述，pET30a-rTTHc室温28 ℃2 mg／mL IPTG 表达系统是表达rTTHc 蛋白的最优选择，也适用于工业化的大批量蛋白表达及疫苗生产的需要。