基于网络药理学及分子对接技术探讨三七治疗膜性肾病的作用机制

李 英，茅燕萍，王亿平，张 磊

（1.安徽中医药大学第一临床医学院，安徽 合肥 230031；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031）

膜性肾病（membranous nephropathy，MN） 是最常见的一种成人肾病综合征，病因不明的患者约为80%，为特发性膜性肾病（idiopathic membranous nephropathy，IMN）或称为原发性膜性肾病（PMN），其余患者发病与药物（如非甾体抗炎药）或其他疾病（如系统性红斑狼疮、乙型肝炎或恶性肿瘤等）有关［1］，称为继发性膜性肾病（secondary membranous nephropathy，SMN）。西医认为MN 属于自身免疫性疾病，其主要病理特征是上皮下免疫复合物的沉积，导致肾小球毛细血管壁增厚并形成钉突；免疫复合物IgG 的沉积和由此引起的补体系统激活、膜攻击复合物C5b-9 的产生，最终造成足细胞损伤，导致肾小球滤过膜的损伤和蛋白尿的形成［2］，此为MN 的重要发病机制。MN 主要临床特征为不同程度的蛋白尿，其中约60%的患者表现为肾病综合征；患者预后差异很大，约1/3 的患者经历自发缓解，1/3 的患者保持不同水平的蛋白尿，其余1/3 进展为晚期肾衰竭［3］。在大多数情况下，MN 患者病程长，治愈相对困难，未缓解患者临床表现为持续性的肾病综合征，若得不到及时治疗可引起血栓栓塞、心血管事件风险、肾功能衰竭等并发症，严重影响患者生活质量及预后［3］，最终30%～40%的患者将在5～15 年内出现肾衰竭，需要透析或肾移植［2］。

三七，具有散瘀止血、消肿定痛、补血益气之效［4］。现代药理研究发现三七化学成分种类丰富，具有止血、抗血栓、降血糖、抗炎、抗氧化、调节免疫等多种药理作用［5］，临床应用广泛。曹恩泽教授系全国名中医，从事中西医结合治疗各种肾脏病工作55 年余，经验丰富，擅用三七来治疗膜性肾病，常用剂量为3～4 g，研粉吞服，疗效显著。本研究采用网络药理学方法探讨三七治疗膜性肾病的潜在靶点及作用机制，并利用分子对接技术进行初步验证，为后续的研究提供理论参考。

1 方法

1.1 药物有效活性成分及其相关靶点的筛选

应用TCMSP 数据库［6］，以“三七”为关键词，以药代动力学为原则，设置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且类药性（drug like，DL）≥0.18 为条件进行初步筛选，以获取三七的有效活性成分及其对应的靶点蛋白，并下载mol2 结构文件（此为后续分子对接所用的小分子配体）；使用Uni-Prot 数据库［7］，将靶点蛋白转化为标准化基因名。

1.2 MN 疾病基因筛选

在GeneCards 数 据 库［8］中 以“membranous nephropathy”为关键词，以获取得到目前已知的与MN相关的疾病靶点。利用Venny2.1 平台，获取三七治疗MN 的潜在作用靶点，即获取二者交集靶点。

1.3 核心靶点的筛选及PPI 网络的构建

将三七与MN 的交集靶点导入至STRING 数据库［9］，物种选择为“Homo sapiens”，靶点关联的置信度设置为最高“highest confidence（0.900）”，其余设置均为默认，剔除未参与蛋白互作的靶点，获取PPI 网络关系，并导入至Cytoscape3.9.1 软件中，利用插件Centiscpae2.2 进行网络拓扑分析，以度值（degree）、接近中心性（closeness centrality）与节点中心性（betweenness centrality）三者为参数，以大于各自的阈值为筛选条件，取三者交集得到核心靶点，并构建PPI 网络图。

1.4 GO 功能与KEGG 通路的富集分析

打开David 数据库［10］，物种选择为人类，按“P＜0.01”设置阈值，对参与蛋白互作的靶点进行GO 功能分析和KEGG 信号通路富集分析。将分析后的数据信息按照P值大小排序，KEGG 信号通路筛选出前20 名导入微生信平台绘制KEGG 富集气泡图；GO 分析中生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function， MF）三者各筛选出前10 名绘制GO 功能三合一柱状图。

1.5 分子对接

将筛选出的三七主要活性成分与主要核心靶点进行分子对接验证。从pdb 数据库［11］中下载靶点蛋白的pdb 结构文件（即受体蛋白），利用PyMol 软件进行去水、去配体等处理后，利用AutoDock 软件进行加氢、计算电荷等，输出为pdbqt 格式文件；小分子配体（mol2 结构文件）经AutoDock 软件处理后也输出为pdbqt 格式文件。对受体蛋白与配体进行分子对接操作并获取二者的结合能，再利用PyMol软件进行可视化处理。

2 结果

2.1 三七的有效活性成分

利用TCMSP 数据库对三七进行检索，得到有效成分119 个，只有8 个有效成分符合药代动力学特征，其中7 个有效成分具有相对应的靶点（表1），1 个有效成分无相关蛋白，予以删除。检索这7 个有效成分对应的靶点蛋白，得到253 个预测作用靶点，经Uniprot 数据库规范基因名并去重后得到184 个药物作用靶点。

表1 三七成分信息Tab 1 Component information of Panax notoginseng

2.2 三七治疗MN 的潜在靶点

在Gene cards 数据库中以“membranous nephropathy”为关键词共检索到3 670 个膜性肾病相关作用靶点，与三七的184 个有效成分作用靶点取交集，得到共同作用靶点127 个，并绘制韦恩图（图1）。

图1 三七与MN 的共同靶点韦恩图Fig 1 Veen diagram of intersection target of Panax notoginseng and membranous nephropathy

2.3 核心靶点及PPI 网络

将共同靶点导入到String 数据库中，将获取的PPI 网络关系导入到Cytoscape 3.9.1 软件中，经Analyze Network 分析并通过可视化处理得到图2，图中气泡越大、相关连接愈粗且愈多的节点表明其在该PPI 网络中也愈重要。筛选后得到转录因子Jun（JUN）、肿瘤抑制基因p53（TP53）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、RAC-α 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、转录因子p65（RELA）等23 个核心靶点，其相关拓扑参数见表2。

图2 三七治疗膜性肾病的交集靶点PPI 网络图Fig 2 PPI network diagram of intersection target of Panax notoginseng in the treatment of membranous nephropathy

表2 核心靶点相关信息Tab 2 Related information of core targets

2.4 富集分析结果

GO 分析共得到804 个条目，其中BP 相关条目有703 个，主要体现在RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调节、转录的正向调节及DNA 模板化、基因表达的正向调控和细胞的凋亡过程及正、负调节等；CC 相关条目55 个，包括细胞质、细胞核、核质、细胞外间隙等部位；MF 相关条目121 个，主要涉及蛋白质结合、相同的蛋白质结合、酶结合等。根据P值大小排序，分别筛选出前10 名，利用微生信平台进行可视化处理后得到如下分析图（图3）。

KEGG 分析共得到171 条通路及其有关信息，其中癌症通路、脂质和动脉粥样硬化、化学致癌-受体活化、人巨细胞病毒感染、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、乙型肝炎、流体剪切应力和动脉粥样硬化、IL-17 通路和TNF 通路等与膜性肾病相关性较强，可能作为三七治疗膜性肾病的重要通路，根据P值大小和富集基因数目筛选出前20 条显著通路，利用微生信网站绘制气泡图如下（图4）。

图4 KEGG 富集分析气泡图Fig 4 KEGG enrichment analysis bubble diagram

2.5 “有效成分-靶点-通路”网络

运用cytoscape3.9.1 软件构建“有效成分-靶点-通路”网络图（图5）。网络图中可以看出，三七具有多种有效活性成分，每种有效成分对应多个靶点蛋白，每个靶点又可连接多种成分、参与多条信号通路，体现了三七所含的多种有效成分，通过多靶点多通路干预治疗膜性肾病。图中节点面积越大、连接越多表明其对膜性肾病的影响越大。

图5 “三七有效成分-靶点-通路”图Fig 5 ' Panax notoginseng active ingredient-target-pathway ' diagram

2.6 分子对接验证结果

根据“有效成分-靶点-通路”网络图和PPI 网络图，分别选择出五种最重要的活性成分与排名前五的核心靶点进行分子对接并计算出结合能，具体结果如下表（表3）。结合能小于-1.2 kcal/mol（1 kcal=4.184 kJ）表明对接结果良好，结合能越低，表明二者结合越稳定。部分结合能较高的分子对接可视化展示图见图6。

图6 分子对接可视化展示图Fig 6 Visual display of molecular docking

表3 分子对接结合能Tab 3 Molecular docking binding energy

3 讨论

近年来，MN 的发生率呈显著上升趋势，且有超过IgA 肾病的趋势，发病年龄上也逐渐年轻化［12］。改善全球肾脏疾病预后组织（KDIGO）提出，所有原发性膜性肾病和蛋白尿患者均应接受最佳支持治疗，对有进行性肾损伤风险的患者应进行免疫抑制治疗［13］。最常用的三种免疫抑制治疗方案有激素联合环磷酰胺、利妥昔单抗或钙调磷酸酶抑制剂等［1］，但各自存在不良反应多、停药后易复发、价格昂贵等缺点，治疗存在一定的局限性。多项研究与名中医经验证实，中医药对本病的病因病机有独到的认识及不可替代的治疗优势，中西医结合治疗本病具有更高的疗效和安全性。

膜性肾病作为一病理形态学诊断名词，中医学并无特定关于此病的记载，由于患者临床多表现为水肿、泡沫尿等，可将其归属为中医“水肿”、“尿浊”、“虚劳”等范畴，早在《黄帝内经》中便已认识到其发病与肺、脾、肾相关［14］，如《素问·至真要大论》指出：“诸湿肿满，皆属于脾。”又如《素问·水热穴论》云：“肾者，胃之关也，关门不利，故聚水而从其类也。上下溢于皮肤，故为跗肿。跗肿者，聚水而生病也。” “……故其本在肾，其末在肺，皆积水也。”《景岳全书》等也有相关论述。肺、脾、肾三脏虚损，脏气不足，摄纳无力，精微物质外泄，即如巢元方《诸病源候论》所说：“劳伤肾虚，不能藏于精，故因小便而精微出也”，导致蛋白尿的产生。当蛋白漏出过多，且脾虚不能运化水谷，导致精微物质来源不足，则先后天均失养，久而形成虚劳。曹恩泽教授认为，MN 患者普遍存在蛋白尿、低白蛋白血症及高脂血症，导致血液浓缩及高凝状态，属中医“瘀血证”范畴，如《金匮要略·水气病脉证并治》所论述“……经为血，血不利则为水，名曰血分。”《血证论》亦曰：“瘀血化水，亦发水肿，是血病而兼水也。”因此瘀血既是本病的病理产物，又可成为新的致病因素，其贯穿病程始终，曹恩泽教授在治疗MN 上多采用活血化瘀类中药，并创立“活血通络”为肾病辨治通用之法［15］，擅用三七消肿、活血兼补益之功，改善肾脏微循环、调整机体功能，益于膜性肾病的改善。

本研究通过构建“化合物-疾病-靶点”调控网络系统全面分析药物三七的有效成分并系统分析化合物与靶点的相互作用关系。其中关键化合物是槲皮素、人参皂苷Rh2、扁桃醇、豆甾醇等。槲皮素因其广泛的药理作用而广泛应用于各种疾病，包括抗肿瘤、抗炎、抗脏器纤维化、抗氧化应激等作用，有动物实验和体外细胞实验表明，槲皮素能够通过NF-κB 和IRF1 信号抑制M5 巨噬细胞极化，从而改善肾损伤，还可抑制M2 巨噬细胞极化，因此可用于防治肾损伤和纤维化［16］。豆甾醇能有效抑制炎症模型中炎症因子IL-1β 和TNF-α 的水平，并且升高抗炎因子IL-10 水平具有良好的抗炎作用外，还具有抗病毒和抗肿瘤等多种生物活性［17］，与KEGG 富集分析得到的多条通路和核心靶点存在重合。人参皂苷Rh2 除了通过诱导细胞凋亡和自噬，广泛应用于各种癌症的治疗外，还具有抗炎、抗过敏、增强免疫力、抗缺氧等多种药理作用［18］，故临床还可用于防治肾脏纤维化，改善MN 预后。

通过PPI 网络分析发现，JUN、TP53、RELA、AKT1、MAPK1 等可能在三七治疗膜性肾病中起关键作用。Jun 转录因子家族属于激活剂蛋白-1（activating protein-1，AP-1）成员之一，其涉及广泛的生物活动，如细胞分化、存活、凋亡、增殖、细胞转化和迁移，是包括癌症和炎症在内的各种疾病的主要靶标［19，20］，在MN 中主要通过参与IL-17 和TNF 等通路及其进一步激活的NF-κB 和MAPK 通路等，对抗免疫炎症反应、抑制肾小管上皮细胞的凋亡从而保护肾脏。TP53 基因是编码肿瘤蛋白p53 的抑癌基因，它的活化对细胞凋亡通路起着至关重要的控制作 用［21］，参 与 了KEGG 前20 条 通 路 中 的15 条 信 号通路，在MN 中也显得尤为重要。AKT 家族在调节生长、增殖、存活、代谢和其他细胞活动中起关键作用［22］，哺乳动物三种亚型中以AKT1 为主，且被其证实在急性肾损伤（AKI）到慢性肾脏病（CKD）进展过程中，它的激活对肾小管间质纤维化和肾小管去分化中起到关键作用［23］，另有动物实验研究证实，增强线粒体功能可以防止肾脏的缺血再灌注损伤，肾小管线粒体AKT1 的激活对AKI 和随后的CKD 发展具有保护作用［24］。另外还有实验证实，通过靶向调控MAPK1 的表达可以抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡并阻滞细胞周期，抑制肿瘤细胞迁移和侵袭［25］，还能能够调节炎症和细胞凋亡介质的 合 成［26］。RELA 是NF-κB 信 号 通 路 中 的 关 键 效应物，它也参与了前20 条通路中的15 条信号通路，在调节肾脏炎症反应中具有重要的作用［27］。

癌症已成为中国最常见的疾病之一，在三七治疗MN 可能的作用机制预测中，癌症通路涉及到54个靶点，主要关乎细胞凋亡和自噬，通过调节一些关键的凋亡信号通路和靶点，例如TNF 相关配体及其受体、NF-κB 通路、TP53 等，将改善肾脏的远期预后［28］。晚期糖基化终产物（AGEs）与AGE 受体RAGE 的结合，在肾组织中结合从而诱发各种病理变化，包括氧化应激、细胞凋亡和炎症（涉及信号通路NF-κB，PI3K / Akt 和MAPK / ERK 的激活），导致进行性肾脏疾病［29］，即使没有糖尿病，在MN 患者中，由于氧化应激和清除受损导致AGEs 的产量增加，进而导致血管损伤，加重病情［30］，通过干预此通路可有效延缓患者慢性肾脏病的进展。IL-17 是由CD4+T 细胞分泌的致炎细胞因子，与机体内多种炎症性疾病密切相关。当表达IL-17 的细胞受到外界刺激时，IL-17 可刺激细胞产生TNF-α 和IL-6，进一步激活NF-κB 信号通路［31］，NF-κB 调节多种基因的表达，这些基因在肾损伤期间的炎症反应中起关键作用［32］；TNF 通路中TNF-α 可诱导许多基因的激活，涉及到NF-κB 通路和MAPK 通路等，二者在调节T 细胞自身免疫和炎症功能方面发挥至关重要的作用，有激活炎症和发生肾脏纤维化的危险［33，34］。

分子对接结果显示，三七主要活性成分甘草素、槲皮素、扁桃醇、豆甾醇、人参皂苷rh2 等与核心靶点对接所需的结合能均小于-1.2 kcal/mol，具有很好的结合活性，说明上述成分在治疗MN 中可能起到关键作用。

综上所述，本研究发现三七治疗MN，通过多条通路、多个靶点起作用，其中癌症通路、AGE-RAGE信号通路、IL-17 通路和TNF 等通路中的蛋白和下游蛋白表达常常是其他通路的启动因子或其他通路中的关键因子，故应尤为重视。本研究揭示了三七通过多条通路、多个靶点综合调控干预治疗MN的可能的作用机制，且经过分子对接技术得以初步验证，但仍需进一步通过体内、外实验来加以验证。

作者贡献度说明：

李英：搜集、统计并处理数据，制作图表并撰写论文；茅燕萍：论文审核指导并修改；王亿平：提供设计思路；张磊：方法指导。

所有作者声明不存在利益冲突关系。