北方主要粗饲料不同组合体外发酵效果的研究

王蕾，栾博宇，苏洋，张国梁，安鼎杰，张世亨，刘基伟，翟博*，李旭*

(1. 吉林省农业科学院，吉林 长春 130033；2. 长春现代农业示范中心有限责任公司，吉林 长春 130117)

我国北方主要的粗饲料有玉米秸秆(CS)、羊草(LC)、玉米秸秆青贮(CSS)等，由于玉米秸秆、羊草、玉米秸秆青贮等作物的纤维素含量高，蛋白质含量低，受细胞壁木质化程度的影响，作牛羊等家畜粗饲料时，消化率很低。为提高作物秸秆的饲用营养价值及适口性，采用物理、化学、生物处理的方法进行处理。但单一的粗饲料通过加工处理来提高饲用营养价值的程度也是有限的，还应注重饲粮的合理组合与搭配。19世纪末德国学者首次发现饲料间存在组合效应，相关学者也证实了饲料间广泛存在这种互作效应[1-2]。我国卢德勋[3]对组合效应的概念也进行了定义，指出当饲料间的互作可使饲料中某养分利用率或采食量高于各饲料的加权值时即产生正组合效应，有利于提高饲料的采食量和利用率。近年来，越来越多的研究者通过对不同种类的粗饲料进行合理配比，提高动物对饲料的采食量以及营养物质消化率，最大限度发挥饲料间的正组合效应，进而对畜禽生产性能产生影响。有关粗饲料组合的研究很多，但玉米秸秆、羊草和玉米秸秆青贮间最优组合的研究尚未见报道。本试验旨在利用体外发酵法，研究玉米秸秆、羊草和玉米秸秆青贮间以不同比例组合体外发酵特性，筛选不同饲料组合的最适比例，提高粗饲料利用率，以期为生产实践中推广利用玉米秸秆、羊草、玉米秸秆青贮等粗饲料组合效应提供理论依据和技术，推动畜牧业的发展。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选择健康状况良好，体重约550 kg的装有永久性瘤胃瘘管的草原红牛阉牛3头，每天饲喂全混合日粮(TMR)2次，自由饮水。瘤胃液供体牛饲粮组成及营养水平见表1。

表1 瘤胃液供体牛饲粮组成及营养水平

1.2 试验饲料

在吉林省公主岭市采集了玉米秸秆青贮、玉米秸秆和羊草3种常用粗饲料，并在实验室测定了其营养成分，结果见表2。

表2 玉米秸秆青贮、玉米秸秆和羊草常规营养成分

为了研究不同粗饲料组合对瘤胃发酵和各种营养物质消化的影响，采用单因素水平试验设计。将羊草与玉米秸秆组合进行体外培养48 h消化试验，组合试验分为7处理，每个处理3个重复，筛选出最优组合；然后选最优羊草-玉米秸秆组合再与玉米秸秆青贮进行组合，进一步筛选出粗饲料最优组合，试验同样分为7处理，每个组合3个重复。饲料间不同的组合及比例见表3。

表3 不同粗饲料组合及比例

1.3 试验方法

1.3.1 体外培养装置

体外产气试验装置“六通路瞬时发酵微量产气全自动记录装置与软件系统”，型号为Qtfxy-6，为吉林省农业科学院畜牧科学分院自主研制。

1.3.2 培养基的配制

厌氧人工瘤胃缓冲液按Menke 等方法配制[3]。

1.3.3 瘤胃液的采集

试验当日晨饲前，利用负压原理从3头瘘管草原红牛瘤胃内采集足量瘤胃液，厌氧无菌条件下搅拌后经4 层纱布过滤分离固体和液体部分。准确称量发酵底物1 g 放入250 mL 发酵罐中，并将其置入39 ℃ 恒温培养箱内预热30～60 min。

1.3.4 体外培养试验及方法

把接收瓶内的瘤胃液与提前配制的人工瘤胃缓冲溶液以体积比1∶4 混合均匀后，准确量取150 mL 混合液，置于提前预热的每个发酵罐中(边操作边通入氮气)，之后继续向各个发酵罐通入氮气以保证厌氧环境。将各个发酵罐在(39.0±0.5)℃ 的水浴摇床中进行体外发酵48 h，同时做空白试验，即产气瓶内不加入发酵底物。记录培养2、4、8、12、24、36、48 h 的产气体积，由各自产气量以及气压进行校正，减去空白发酵瓶产气量即为产气量。

1.3.5 测定指标及方法

干物质消失率(DML)测定：在体外48 h 发酵结束后，迅速将其放置碎冰中终止发酵，用已编号并称重的尼龙布(40 μm)过滤后，再经蒸馏水冲洗发酵罐数次直至干净，以确保发酵罐内无残留物，待瘤胃液过滤置于接受瓶中，然后将尼龙布小心无损地转移到烘箱中以65 ℃烘48 h 至恒重。

pH值测定：用酸度计(pHS-3C，上海雷磁仪器厂)测定。

微生物蛋白(MCP)测定：MCP的分离采用差速离心法。最后将收集的沉淀小心无损地转移到消化管中，按凯氏定氮法，用丹麦FOSS 凯氏定氮仪测定MCP浓度。

氨态氮(NH3-N)浓度测定：采用靛酚比色法进行测定。

挥发性脂肪酸(VFA)测定：用气相色谱仪(6890N，Agilent，美国)测定。色谱柱为HP19091N-213型毛细管柱(Agilent，美国)。色谱条件：进样口温度220 ℃，氮气流量2.0 mL/min，分流比为40∶1，进样量0.6 μL，程序升温模式(120 ℃ 3 min 然后以10 ℃/min 升至180 ℃，保持1 min)，火焰氢离子检测器(FID)温度250 ℃，FID显示空气、氢气和氮气流量分别为45、40、45 mL/min。

1.3.6 组合效应的计算

单项组合效应指数(SFAEI)与综合组合效应指数(MFAEI)计算方法如下：

SFAEI=(组合后实测值-加权估算值)/加权估算值；

加权估算值=一种饲料的实际测定值×所占比例+另一种饲料实际测定值×所占比例；

MFAEI为各项单项组合效应值之和。

1.4 数据统计与分析

所有数据先用Excel软件进行初步处理，然后利用SPSS 19.0中的ANOVA进行方差分析，差异显著时用Duncan’s法进行多重比较。试验结果用“平均数±标准差”表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 羊草与玉米秸秆的组合效应

由表4可见，羊草与玉米秸秆不同比例组合间的产气量均随发酵时间的延长而增加，且在同一时间点的产气量是随玉米秸秆比例的增加而降低。除2 h外，各时间点中，100∶0的组合比例产气量极显著高于其他组合(P<0.01)。

表4 羊草与玉米秸秆不同比例组合对不同体外发酵时间产气量的影响 mL

由表5可见，羊草与玉米秸秆不同比例组合体外培养48 h，DML、pH值及MCP、NH3-N 的浓度，DML产量均随玉米秸秆比例的增加而呈现增加的趋势，0∶100比例组合极显著高于其余比例组合(P<0.01)；各比例组合间pH值差异不显著(P>0.05)，其pH值变化范围在6.74～6.82；MCP产量均随玉米秸秆比例的增加而呈现减少的趋势，各组合间存在差异极显著(P<0.01)；而NH3-N浓度随玉米秸秆的比例的增加而增加，其变化范围在24.34～27.13 mg/dL。

表5 羊草与玉米秸秆不同比例组合对体外培养48 h DML、pH值 及MCP、NH3-N浓度的影响

羊草与玉米秸秆不同比例组合体外培养48 h，培养液中VFA浓度的变化见表6。由表6可见，羊草∶玉米秸秆不同比例组合对乙酸、丙酸、丁酸、总挥发性脂肪酸浓度存在极显著影响(P<0.01)；乙酸、丙酸与总挥发性脂肪酸浓度在羊草∶玉米秸秆为60∶40时达到最大值58.36、38.77、107.52 mmol/L；丁酸在50∶50达到最大值，各比例浓度变化范围在9.01～11.25 mmol/L之间。

表6 羊草与玉米秸秆不同比例组合对体外培养48 h 培养液VFA 浓度的影响

羊草与玉米秸秆的组合效应见表7。从单项组合效应指数评定发现，乙酸和丙酸这2个指标的各比例组合效应的变化规律一致，且在60∶40出现最大值，产气量、微生物蛋白最值也出现在60∶40。以综合组合效应指数评定时发现，羊草与玉米秸秆组合时，各比例组合均为正组合效应，其效应值随玉米秸秆比例的增加呈现先增加后降低的趋势，在60∶40出现最大值，为0.688 2，因此最优羊草∶玉米秸秆比例为60∶40。

表7 羊草∶玉米秸秆的组合效应

2.2 羊草-玉米秸秆与玉米秸秆青贮的组合效应

羊草-玉米秸秆与玉米秸秆青贮不同比例组合在不同体外发酵时间的产气量见表8。由表8可见，最优羊草-玉米秸秆组合与玉米秸秆青贮组合的产气量随发酵时间的延长而增加，且在同一时间点的产气量是随玉米秸秆青贮比例的增加而降低。在24 h和48 h时间点中，羊草-玉米秸秆∶玉米秸秆青贮100∶0比例组合的产气量显著高于其他组合(P<0.01)。

羊草-玉米秸秆与玉米秸秆青贮不同比例组合体外培养48 h，DML、pH值 及MCP、NH3-N浓度的测定结果见表9。由表9可见，各比例组合间pH值无显著差异(P>0.05)，其pH值变化范围为6.73～6.8；干物质消失率、微生物蛋白和氨态氮浓度产量均随玉米秸秆青贮比例的增加而呈现减少的趋势，干物质消失率各组合间存在极显著差异(P<0.01)，微生物蛋白和氨态氮各组合间存在显著差异(P<0.05)。

表9 羊草-玉米秸秆与玉米秸秆青贮不同比例组合对体外培养48 h DML、pH值 及MCP、NH3-N 浓度的影响

羊草-玉米秸秆与玉米秸秆青贮不同比例组合体外培养48 h ，培养液中挥发性脂肪酸的浓度变化见表10。不同羊草-玉米秸秆∶玉米秸秆青贮对乙酸、总挥发性脂肪酸的浓度存在极显著影响(P<0.01)。丙酸在比例为100∶0和50∶50组合差异极显著(P<0.01)，其他各组差异不显著(P>0.05)。丁酸各比例组合差异不显著(P>0.05)。乙酸、丙酸、丁酸与总挥发性脂肪酸浓度在羊草-玉米秸秆∶玉米秸秆青贮为50∶50时均达到最大值52.52、32.34、10.07、95.63 mmol/L。

表10 羊草-玉米秸秆与玉米秸秆青贮不同比例组合对体外培养48 h 培养液VFA 浓度的影响

羊草-玉米秸秆∶玉米秸秆青贮的组合效应见表11。从单项组合效应指数(SFAEI)评定发现，产气量、微生物蛋白和丙酸这3个指标的各比例组合效应的变化规律一致，且在50∶50出现最大值，干物质消失率、氨态氮在比例组合为50∶50出现最大值。以综合组合效应指数(MFAEI)评定时发现，在80∶20、60∶40、50∶50时为正组合效应，且其效应值随玉米秸秆青贮比例的增加呈现增加的趋势，在50∶50时出现最大值。在40∶60时开始出现负组合效应，因此，最大值组合效应羊草-玉米秸秆∶玉米秸秆青贮为50∶50，即羊草∶玉米秸秆∶玉米秸秆青贮为30∶20∶50。

表11 羊草-玉米秸秆∶玉米秸秆青贮的组合效应

3 讨论

3.1 不同时间点产气量的变化

产气量可以反映粗饲料在反刍动物瘤胃内的降解特性[4]。在一定时间内，瘤胃内的产气量不仅与瘤胃微生物的活力、微生物对底物的利用程度有关，还与粗饲料组成有关，直接反映了饲粮营养价值的高低[5]。如果饲粮中富含较多非结构性碳水化合物，并且能快速发酵，被瘤胃微生物利用，那么其产气量就较多。研究发现，玉米青贮中富含易发酵的非结构性碳水化合物，使饲粮的降解速率高且产气体量多[6-7]。本试验中，羊草：玉米秸秆组合、羊草-玉米秸秆：玉米秸秆青贮组合的产气量都随发酵时间的增加而增加，24～36 h增加迅速，而36～48 h增加减弱。这是由于发酵前期，可发酵底物较多，瘤胃微生物对饲料的作用强，因此产气量增加迅速，而后期可发酵底物减少，瘤胃微生物对饲料的作用变弱，产气量逐渐趋于平稳。试验中不同饲料组合，其非结构性碳水化合物与碳水化合物比例间有所差异，在同一时间点的产气量随不同比例组合间的产气规律有所不同，这与李妍的研究一致[8]。还有研究发现，通过体外法的产气量和化学成分结合估计的消化率与体内法的消化率高度相关，且体外发酵产气量与饲粮在体内的消化率呈正相关[9]。

3.2 不同粗饲料组合对体外发酵48 h的pH值、DML、NH3-N、MCP的影响

正常情况下，瘤胃pH值保持在5.0～7.5之间，通常瘤胃发酵时pH值范围在6.2～7.0之间，本试验的2种组合pH值分别在6.74～6.82和6.73～6.80，都是瘤胃发酵适宜的pH值范围，可维持体外发酵环境的稳定，适合瘤胃微生物的繁殖，与李妍等[8]、Hassanat等[10]研究基本一致，本试验中瘤胃的pH值为瘤胃微生物提供了适宜的发酵条件，有利于纤维分解，生成动物机体所需的挥发性脂肪酸。

DML可以反映出粗饲料中纤维被微生物利用的程度，粗饲料中的纤维种类及其含量都是影响DML的重要因素，DML高，表明饲料中纤维种类含量适宜，被动物消化利用充分，发酵越好，反之则越差[11]。本试验中，羊草∶玉米秸秆不同比例组合体外培养48 h DML 的浓度随玉米秸秆比例的增加而增加；羊草-玉米秸秆与玉米秸秆青贮不同比例组合体外培养48 h DML的浓度，随玉米秸秆青贮比例的增加而减少。可能是玉米秸秆有适宜的纤维物质，被瘤胃微生物利用，使干物质消失率随其比例的增加呈现增加趋势，而玉米秸秆青贮经发酵后形成的酸性环境可能对微生物生长有抑制作用，使干物质消失率随其比例的增加呈现降低的趋势。这与李妍等[8]、韩肖敏等[12]研究一致[8-12]。

MCP反映出饲料给微生物提供可利用蛋白的能力[13]，它主要取决于含氮化合物的降解数量和速度。瘤胃内含氮物质主要分解产物是NH3-N，其浓度因饲料不同差异较大，但可以反映瘤胃微生物降解饲料蛋白，合成MCP的动态平衡情况。当能氮比例适宜时，瘤胃微生物合成 MCP 的效率能够最大限度的提高[14]。本试验中，羊草∶玉米秸秆组合体外培养48 h后，MCP的浓度随着玉米秸秆比例的增加而减少，可能是玉米秸秆比例增加为瘤胃微生物活动提供了充足的发酵底物，导致NH3-N浓度过高，从而限制微生物利用NH3-N合成MCP；羊草-玉米秸秆与玉米秸秆青贮组合体外培养48 h后，MCP的浓度随着玉米秸秆青贮比例的增加有减少的趋势，但是变化不大，可能因为羊草与玉米秸秆组合中玉米秸秆虽然发酵底物产生过高的NH3-N抑制了MCP的合成，但是随着玉米秸秆青贮的增加，玉米秸秆青贮经发酵后pH值降低，NH3-N浓度降低，抑制微生物生长，因此MCP的浓度变化不大。

NH3-N是由饲料中含氮物质分解产生的，可以反映出日粮中蛋白降解及被微生物重新利用合成菌体蛋白的状况，适宜的NH3-N浓度有利于微生物生长和菌体蛋白合成，是瘤胃代谢中的重要指标[15]。研究显示，NH3-N浓度过高，瘤胃微生物降解氮源释放氨气的速率超过微生物利用NH3-N合成MCP速率，这样增加了瘤胃氮循环中氮素的损失，NH3-N浓度过低，会限制微生物利用NH3-N合成MCP和分解纤维素的速率[16-17]。Hoover等[18]研究瘤胃微生物生长适宜的 NH3-N 浓度为3.3～8.0 mg/dL，实际上 NH3-N 浓度多在1～76 mg/dL 之间变化。本试验中，NH3-N 浓度为 23.35～27.13 mg/dL，都在正常浓度范围内。羊草∶玉米秸秆组合体外培养48 h NH3-N 的浓度，随着玉米秸秆比例的增加而增加，可能是玉米秸秆与羊草组合产生较多的含氮物质可被微生物利用；羊草-玉米秸秆与玉米秸秆青贮组合体外培养48 h NH3-N 的浓度，随着玉米秸秆青贮比例的增加而减少，可能是玉米秸秆青贮经发酵后pH值降低，抑制微生物生长，导致NH3-N浓度反而降低。

3.3 不同粗饲料组合对VFA含量的影响

VFA是饲料发酵水平的重要指标，能够供给生命所需 70%～80% 的能量，其中95% VFA 为乙酸、丙酸和丁酸[19]，是瘤胃微生物维持和生长的主要能量来源，乙酸是合成乳脂的主要成分，丙酸是合成葡萄糖的前体物质，可为机体供应所需的大部分能量[20]。VFA浓度是反映瘤胃中碳水化合物被消化和微生物活力的重要指标[21]。VFA可使瘤胃保持酸性环境，有助于瘤胃微生物繁殖。研究显示，粗饲料中含有大量的纤维类物质，可在瘤胃中发酵产生较多的乙酸[22]。本试验中，两种不同组合饲料在发酵48 h时，均以乙酸>丙酸>丁酸，这可能是因为粗饲料含有较多的纤维物质，乙酸正是由微生物发酵饲料中的纤维物质生成的，在瘤胃中发酵会产生相对较高比例的乙酸和比例较低的丙酸，这与李妍等[8]研究结果基本一致。本试验结果显示，在羊草∶玉米秸秆组合中，乙酸、丙酸与总挥发性脂肪酸浓度随玉米秸秆比例的增加呈现先增加后降低的趋势，且在60∶40时达到最大值，可能是在达到最大值前玉米秸秆中的纤维物质适宜，被瘤胃微生物利用，生成动物机体所需的挥发性脂肪酸，但达到最大值后，随着玉米秸秆比例的增加，纤维物质增多，抑制了降解速率，生成挥发性脂肪酸下降；在羊草-玉米秸秆与玉米秸秆青贮组合中，乙酸、丙酸、总挥发性脂肪酸浓度随玉米秸秆青贮比例的增加也呈现先增加后降低的趋势，在50∶50时达到最高值，可能是玉米秸秆青贮比例小，对羊草-玉米秸秆组合的影响不大，但随着玉米秸秆青贮比例加大，pH值低，抑制纤维物质的发酵，使生成挥发性脂肪酸下降。2种不同组合饲料在发酵48 h时乙酸、丙酸、丁酸、总挥发性脂肪酸浓度出现最大值的比例和综合组合效应评价指数相一致。

3.4 混合粗饲料不同组合比例对组合效应指数的影响

组合效应是不同饲料来源的营养素之间相互作用的结果，包括营养物质、非营养物质以及抗营养物质之间互作的整体效应[23]。卢德勋[3]对饲料组合效应进行分类指出，饲料之间互作有正、零、负组合效应。组合效应有单项组合效应和综合组合效应。单项组合效应仅是从单一指标进行评定，很难准确评定饲料间利用率，因此需要结合各指标来进行综合评定。综合组合效应指数是各单项指标的加权计算值，能够对整个饲料组合试验结果进行综合评定。在评定饲料组合效应时，只有结合综合指标对组合效应结果进行综合评定，才能从整体水平上得出更为准确、客观的结论，本试验也证实了该结论。本试验从多项组合效应评定，羊草与玉米秸秆组合时，各比例组合均为正组合效应，其效应值随玉米秸秆比例的增加呈现先增加后降低的趋势，在60∶40出现最大值；羊草-玉米秸秆∶玉米秸秆青贮组合时，其效应随玉米秸秆青贮比例的增加呈现先增加后降低的趋势，在40∶60时出现负组合效应，因此，最大组合效应羊草-玉米秸秆∶玉米秸秆青贮为50∶50。不同组合粗饲料之间适当比例的互作，可以提高饲料的整体发酵水平和消化利用率。

4 结论

本试验结果表明，将玉米秸秆青贮、玉米秸秆、羊草以不同比例组合时，表现出不同程度的正组合效应。从综合组合效应指数得出，羊草∶玉米秸秆组合为60∶40时产生最大正组合效应，对体外瘤胃发酵影响较大，提高了发酵产气量、微生物蛋白、乙酸和丙酸，使得这些指标也在60∶40出现最大值。羊草-玉米秸秆∶玉米秸秆青贮组合为50∶50时产生最佳正组合效应，此比例组合时发酵产气量、干物质消失率、微生物蛋白、氨态氮、乙酸和丙酸这些指标也在50∶50出现最大值。