链霉菌YJ-81 中活性成分的分离、鉴定及除草活性

代义乐, 陈可可, 刘东丽, 蔡加岭, 吴 越, 张 辉*,,, 张 继*,,3

(1.台州科技职业学院 台州市园艺生物技术实验室，浙江 台州 318020；2.东北农业大学 生命科学学院，哈尔滨 150030；3.东北农业大学 植物保护学院，哈尔滨 150030)

微生物天然产物在新农药的开发中占据着极其重要的地位，一些微生物天然产物可以直接开发成为农药，如阿维菌素、井冈霉素、双丙氨膦等，此外一些重要的农药品种，如甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂等是来源于微生物产生的先导化合物[1]。据2018 年全球农药市场销售额显示，基于天然产物的杀虫剂、杀菌剂和除草剂约占整个农药市场销售额的65%、45%和16%[2]。除草剂的应用是保障农业增产和农民增收不可缺少的农业措施，但近年来除草剂的大量使用和滥用已造成了环境污染、农产品农药残留、杂草产生严重抗药性等一系列生态和健康问题。因此，开发高效、低毒、环境友好型绿色除草剂已成为新农药开发的重要方向[3]。微生物天然产物是微生物在生长过程中产生的次级代谢产物，与化学农药相比，具有结构新颖、靶标特异性强、易降解、污染小等优点，是绿色农药的重要源泉。

根际是指植物根系周围、受根系生长影响的土体，在此狭窄的区域内存在丰富的微生物群落，植物根系、土壤和微生物相互作用形成独特的微生态环境。根际区域内的微生物被称为根际微生物，在植物-土壤-微生物互作体系中占有重要的地位，通过直接和间接的方式参与植物的生长发育、养分循环和抑制植物病原菌的生长，被称为植物的第二套基因组[4]。研究表明，根际区域微生物的种类和数量明显高于非根际区域，许多根际微生物能通过产生多种具有生物活性的代谢产物影响植物的抗病虫害能力。因此，对植物根际微生物资源的挖掘利用被认为是微生物天然产物药物发现的重要途径之一[4]。岩蕨是一种原始的、落叶多年生草本植物，生长于我国东北、华北和西北地区的林下岩石缝，在这种特殊的生境和长期的进化过程中，岩蕨会在根际招募或富集一些区别于其他高等植物的微生物群落，但目前尚未见关于岩蕨根际微生物的研究报道。笔者在对黑龙江地区岩蕨根际微生物的分离筛选过程中，发现了一株具有抗真菌和除草活性的微生物菌株YJ-81。为了进一步探明其所产生的活性化合物，本研究对菌株YJ-81 的发酵液进行了活性化合物的分离鉴定，并对活性化合物的除草活性和作物安全性展开了研究。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试材料 供试菌株YJ-81 分离自黑龙江省哈尔滨市宾县二龙山上采集的岩蕨植物根际土，菌株保存于东北农业大学生命中心菌种保藏中心。

反枝苋Amaranthus retroflexus、藜Chenopodium album、稗草Echinochloa crusgalli、狗尾草Setaria viridis、马齿苋Portulaca oleracea、水稻Oryza sativa、番茄Lycopersicon esculentum、西瓜Citrullus lanatus和玉米Zea mays种子购买于种子专卖店。

24%烟嘧 • 莠去津可分散油悬浮剂 (nicosulfuron + atrazine 24% OD，侨昌现代农业有限公司)。

1.1.2 培养基 产孢培养基和种子培养基分别为ISP2 固体培养基和GY 液体培养基[5]。发酵培养基的配方为：酵母浸粉0.5%，棉籽饼粉2%，葡萄糖1%，玉米淀粉3%，MgSO4•7H2O0.1%，CaCO30.2%，麦芽糊精2%，pH7.2～7.4。1.1.3试剂与仪器 层析柱硅胶(200～300 目，筛孔径74～48μm)和薄层层析硅胶(GF254 型)(青岛海洋化工厂)；层析柱凝胶SephadexLH-20(GE公司)；所用试剂均为分析纯。Agilent1100 型高效液相色谱仪(HPLC，美国Agilent 公司)；半制备色谱柱(ZorbaxSB-C18，250mm×9.4mm，5 μm)；Aglient1100LC 液质联用仪(美国Aglient 公司)；BrukerDRX-400 核磁共振仪(Bruker Corporation，以CDCl3为溶剂)；SPAD-502 PLUS 叶绿素仪(KONICAMINOLTA，日本)。

1.2 试验方法

1.2.1 基于16SrRNA 序列的YJ-81 菌株鉴定 将菌株YJ-81 的孢子接种至GY 液体培养基中，于28℃、250r/min 下培养5d 后，离心收集菌丝体，并进行基因组的提取[4]。提取的基因组DNA 电泳检测合格后，利用16SrRNA 通用引物2 7 f (5′-A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G-3′)/1521R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′) 和FastPfu 高保真DNA 聚合酶进行PCR。50μL PCR 反应体系：通用引物27f 和1521R 各1μL，Buffer10μL，dNTPs5μL，基因组DNA1μL，FastPfu 高保真DNA 聚合酶1μL，ddH2O31μL。PCR 反应条件为：95℃5min；95℃40s，55℃45s，72℃1.5min，30 个循环；72℃10min，4℃保温。PCR 产物由吉林省库美生物科技有限公司测序，测序结果在EzBioCloud 网站中进行比对[6]，并通过MEGA7.0 软件构建系统发育树[7-8]。

1.2.2 菌株YJ-81 的发酵培养及发酵液处理 菌株YJ-81 的孢子接种于含50mLGY 液体培养基的250mL 三角瓶中，于28℃、250r/min 下培养2d。然后按照6%比例将其接种到发酵培养基中，于28℃、250r/min 下摇床培养7d。发酵结束后，发酵液(15L)于4000r/min 下离心以分离发酵上清液和菌丝体。发酵上清液用3 倍体积的乙酸乙酯萃取后，合并乙酸乙酯相，经旋转蒸发仪浓缩至膏状(6.6g)，然后用少量甲醇溶解，备用。菌丝体用等体积甲醇浸提2～3 次，将甲醇相旋转蒸发至膏状 (8.3 g)，并用少量甲醇溶解备用。

1.2.3 菌株YJ-81 发酵液除草活性初筛 将1.2.2 节得到的发酵液上清样品(0.08g)和菌丝体浸提样品(0.11g)分别用100μL 的甲醇溶解，然后用含有0.1%吐温-80 的无菌水溶液稀释100倍，备用。将大小均匀的反枝苋种子用无菌水冲洗，摆放在含有滤纸片的培养皿内，每皿30 粒。每个平板中加入4mL 待测样品，设置无菌水及含有0.1%吐温-80 的无菌水溶液为对照组，25℃暗培养3d 后统计实验结果，每组重复3 次。

1.2.4 活性化合物的分离 化合物的分离采用除草活性跟踪法进行。将上述的发酵上清液样品和菌丝体浸膏合并(14.9g)，合并后的浸膏硅胶柱层析，氯仿-甲醇溶剂(体积比：100:0,90:10,80:20,70:30,60:40,50:50)梯度洗脱，洗脱液合并后得到组分Fr.1～Fr.3；根据组分的除草活性分析，组分Fr.1(4.7g)进一步进行硅胶柱层析，氯仿-甲醇溶剂(体积比：100:0,96:4,92:8,88:12,84:16,80:20,76:24;72:28,68:32,84:36,60:40)梯度洗脱得到组分Fr.1.1～Fr.1.10，合并组分Fr.1.1-Fr.1.4(2.1g)，经凝胶柱层析，采用乙醇作为溶剂进行洗脱得到活性组分Fr.1.1.2(1.1g)，再经HPLC 半制备柱层析，MeOH-H2O(80:20，体积比)，流速为1.5mL/min，检测波长254nm，得到活性化合物1(261.4mg，tR=13.4min)。

1.2.5 化合物的除草活性测定和作物安全性试验

1.2.5.1 杂草和作物种子平皿发芽试验 将活性化合物1 用微量甲醇溶解，然后用含有0.1%吐温-80的无菌水溶液稀释至最终质量浓度为100 mg/L，备用。将消毒后的杂草种子 (狗尾草、反枝苋、藜、马齿苋、稗草) 或作物种子 (番茄、玉米、西瓜、水稻) 用无菌镊子摆入含有滤纸的平皿内，每皿30 粒杂草种子或10 粒作物种子，并加入4 mL药液，以含有0.1%吐温-80 的无菌水溶液作为空白对照，以24% 烟嘧 • 莠去津OD 作为药剂对照。25 ℃暗培养3 d，统计种子的发芽率、根长及芽长，每个处理3 次重复。

1.2.5.2 杂草和作物盆栽试验 将无菌土置于干净的花盆中，浇透水，然后将杂草或作物种子均匀的洒在土壤里面，上面覆盖一层薄薄的土壤，每天观察，及时浇水。待杂草长至3 叶期时，叶面喷施100 mg/L 化合物1 的药液，以含有0.1%吐温-80 的无菌水溶液作为对照。每处理重复3 次。7 d 后观察并统计杂草或作物枯萎程度。剪取作物地上部分称量鲜重，并计算鲜重抑制率[9]。

1.2.5.3 玉米的安全性实验 按照上述方法进行玉米的盆栽试验，待玉米长至3～4 叶期时，分别喷施不同质量浓度 (200、400、600、800 和1000 mg/L)的化合物1 至玉米叶片上，以不含化合物的溶液为对照。7 d 后，采用叶绿素仪测试叶片中的叶绿素含量，每片叶子取上、中、下3 部分进行测定，每个部位测定3 次，取平均值。叶绿素含量测定结束后，取玉米的地上部分，并称重。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0 软件Duncan 法分析处理组和对照组之间的差异显著性 (P< 0.05)。

2 结果与分析

2.1 菌株YJ-81 的鉴定

菌株YJ-81 的16S rRNA 基因序列全长为1491 bp (GenBank 登录号：MW781816)，将该序列在EzBioCloud 网站上进行比对，结果显示其与链霉菌Streptomyces antimycoticusNBRC 12839T、Streptomyces melanosporofaciensDSM 40318T、Streptomyces geldanamycininusNRRL B-3602T、Streptomyces mordarskiiNRRL B-1346T以及Streptomyces yatensisNBRC 101000T的序列相似性分别为99.65%、99.59%、99.58%、99.30% 和99.24%。使用MEGA7 软件进行系统发育树构建，结果表明菌株YJ-81 与以上菌株形成了稳定的分支 (图1)。以上结果表明，菌株YJ-81 为链霉菌属的一员。

图1 利用临近法 (neighbor-joining method) 构建的菌株YJ-81 系统发育树Fig.1 The phylogenetic tree of strain YJ-81 constructed using neighbor-joining method

2.2 菌株YJ-81 的发酵液除草活性

如图2 所示，用含有0.1%吐温-80 的无菌水处理反枝苋种子后，种子的萌发基本不受任何影响，而用菌株YJ-81 发酵上清液和菌丝体浸提液稀释100 倍后处理，仍对反枝苋种子发芽具有强烈的抑制作用，表明菌株YJ-81 产生了具有除草活性的次级代谢产物。

图2 菌株YJ-81 发酵液对反枝苋种子萌发的影响Fig.2 Effect of strain YJ-81 on the seed germination of A.retroflexus

2.3 活性化合物的分离鉴定

采用除草活性跟踪法对菌株YJ-81 产生的除草活性化合物进行分离，最终得到黄色粉末状的单体化合物1。化合物1 的高分辨质谱HR-ESIMS 显示573.2821 [M-H]‒(C30H41N2O9的计算值为573.2812)，可以推知其分子式为C30H42N2O9，不饱和度为11。化合物1 的1H NMR 在δ0.82、1.11、1.76 和2.03 具有特征的甲基信号，在δ3.31、3.34、3.35 具有特征的甲氧基信号，其13C NMR 在δ155.7、168.9、184.1 和187.8 具有特征的酯羰基和酮羰基信号以及在δ113.2～144.7 的10 个烯碳信号，它们占据9 个不饱和度，说明化合物1 还有2 个环占据另外2 个不饱和度 (表1)。

表1 化合物1 (除莠霉素A) 在氘代氯仿中的核磁数据(400 MHz for 1H NMR and 100 MHz for 13C NMR)Table 1 The 1H NMR and 13C NMR data of compound 1 (herbimycin A) in CDCl3 (400 MHz for 1H NMR and 100 MHz for 13C NMR)

通过与文献[10-11] 对比，发现化合物1 与herbimycin A (除莠霉素A) 的核磁共振数据基本一致 (表1)，而且其旋光数据 (+ 203.0 (c0.15,CHCl3)) 与文献报道数据 (+ 222.35 (c0.17,CHCl3))[12]也基本一致，因此化合物1 的结构鉴定为除莠霉素A，结构如图式1 所示。

2.4 活性化合物的除草活性

2.4.1 活性化合物对杂草种子萌发和生长的影响

如图3、图4 和表2 所示，化合物1 对狗尾草、反枝苋、藜、马齿苋及稗草的种子萌发和生长产生很强的抑制作用，抑制作用明显强于同等浓度的对照药剂24%烟嘧•莠去津OD。当化合物质量浓度为100 mg/L 时，可完全抑制狗尾草与稗草种子的萌发 (表2)。

表2 化合物1 和对照药剂24%烟嘧 • 莠去津OD 对杂草和作物种子的抑制作用Table 2 Inhibitions of compound 1 and nicosulfuron + atrazine 24% OD on seeds of weeds and crops

图3 化合物1 和对照药剂24%烟嘧 • 莠去津OD (YH) 对杂草反枝苋 (a)、马齿苋 (b)、藜 (c)、狗尾草 (d) 和稗草 (e) 种子萌发的影响Fig.3 Effects of compound 1 and nicosulfuron + atrazine 24% OD (YH) on the germination of A.retroflexus (a), P.oleracea (b), C.album (c), S.viridis (d) and E.crusgalli (e)

图4 化合物1 和对照药剂24%烟嘧 • 莠去津OD (YH) 苗期处理对反枝苋 (a)、马齿苋 (b)、藜 (c)、狗尾草 (d) 和稗草 (e) 生长的影响Fig.4 Effects of compound 1 and nicosulfuron + atrazine 24% OD (YH) on the growth of A.retroflexus (a),P.oleracea (b), C.album (c), S.viridis (d) and E.crusgalli (e) in the seedling stage

图式1 化合物1 (除莠霉素A) 的结构式Scheme 1 Structural formula of compound 1 (herbimycin A)

虽然化合物1 对马齿苋和藜的种子萌发率的抑制作用较弱，但对马齿苋和藜萌发后的芽长和根长的抑制作用明显，特别是对芽长的抑制率可达100%。待杂草生长至三叶期时，喷施100 mg/L化合物1 处理7 d 后，狗尾草与稗草的叶片部分出现黄化，植株矮化明显，叶片轻微扭曲；反枝苋出现严重叶片扭曲、黄化，约有2/3 以上的叶片干枯死亡；马齿苋植物矮化明显，叶片发黄、萎缩严重；藜的叶片基本全部枯萎死亡，生长受到强烈抑制 (图4)。从图4 中可明显看出，与对照药剂24%烟嘧 • 莠去津OD 相比，化合物1 对除了稗草之外的其他4 种杂草的抑制作用更强。以上试验结果说明，活性化合物1 在苗期喷施处理中，能很好地抑制杂草幼苗的生长，尤其是对阔叶类的杂草效果最为明显。

2.4.2 活性化合物对作物安全性试验结果 100mg/L质量浓度下，化合物1 对番茄、西瓜、水稻和玉米的种子萌发具有不同程度的抑制作用(图5)。虽然对种子的萌发率影响较弱，但对种子的芽长和根长的影响显著。其中，对番茄和西瓜的芽长以及水稻的根长抑制率均达到100%，但对玉米的芽长抑制率仅为26.31%(表2)。对比发现，化合物1 对玉米种子萌发率的影响强于24%烟嘧•莠去津OD，但对番茄种子萌发率的影响弱于24%烟嘧 • 莠去津OD；化合物1 对水稻和西瓜种子萌发率也有一定的影响，而24%烟嘧 • 莠去津OD 对水稻和西瓜种子萌发率无影响；化合物1 对以上4 种作物种子的芽长和根长的影响均显著强于24%烟嘧 • 莠去津OD。100 mg/L 的化合物1 对作物安全性的苗期喷施实验结果如图6 所示，其中对番茄的抑制效果较为强烈，植株矮化明显，叶片可在短时间内出现大量黑色斑点，然后叶片发黄失绿、萎蔫，直至枯萎；对西瓜、水稻和玉米则无明显抑制作用。以上结果表明，该化合物适合部分作物苗后除草。

图5 化合物1 (100 mg/L) 对玉米 (a)、西瓜 (b)、水稻 (c)、番茄 (d) 种子的根和芽生长的影响Fig.5 Effect of compound 1 (100 mg/L) on roots and shoots of Z.mays (a), C.lanatus (b), O.sativa (c),and L.esculentum (d) seeds

图6 化合物1 (100 mg/L) 苗期处理对玉米 (a)、西瓜 (b)、水稻 (c)、番茄 (d) 生长的影响Fig.6 Effect of compound 1 (100 mg/L) on growth of Z.mays (a), C.lanatus (b), O.sativa (c) and L.esculentum (d)in seedling stage

待玉米长至3 叶期，喷施不同质量浓度 (200、400、600、800 和1000 mg/L) 的化合物1 7 d 后的试验结果如图7 所示。与喷施含有0.1%吐温-80的无菌水处理对照组相比，即使喷施1000 mg/L的化合物1，玉米的叶片不会出现任何药害症状。200～1000 mg/L 除莠霉素A 处理后，玉米地上部分鲜重与对照组相比差异不显著；200～800 mg/L除莠霉素A 处理后，玉米叶片中叶绿素含量与对照组相比差异不显著，1000 mg/L 处理组与对照组差异显著，但200、800 和1000 mg/L 处理组之间叶片叶绿素含量差异不显著 (表3)。以上结果表明，化合物1 对玉米的安全性高。

表3 化合物1 对玉米的安全性Table 3 The safety of tested compound 1 to Z.mays

图7 不同浓度的化合物1 苗期处理对玉米生长的影响Fig.7 Effect of different concentrations of the compound 1 on the growth of Z.mays in the seedling stage

3 结论与讨论

本研究从岩蕨植物根际土壤中分离出一株具有除草活性的链霉菌YJ-81，并鉴定其产生的除草活性化合物为除莠霉素A。除莠霉素A 对玉米田间的杂草，如狗尾草、反枝苋、藜、马齿苋及稗草的种子萌发具有显著的抑制作用，特别是对狗尾草和稗草可达到100%抑制，同时对测试作物番茄、西瓜、水稻和玉米均有不同程度的抑制作用。盆栽试验结果显示，除莠霉素A 对番茄植株的抑制作用较强，而对玉米、水稻和西瓜基本无抑制作用，特别是喷施除莠霉素A 的质量浓度为1000 mg/L 时对玉米仍无药害作用，表明除莠霉素A 对玉米的安全性高，可开发为选择性除草剂，用于玉米田间的苗后除草。

除莠霉素最早是由日本科学家从吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicusAM-3672 中分离出的一组苯安莎类化合物，因具有除草活性而得名[10]，目前已从微生物中分离出除莠霉素A～F 和二氢除莠霉素A、B、C 等组分[13-16]。国内外对于除莠霉素的研究大多集中在其抗肿瘤活性方面，研究表明，除莠霉素A 可通过抑制热休克蛋白90 (heat shock protein 90, HSP90) 的活性而抑制肿瘤细胞的分裂增殖[17]。早期的研究表明，除莠霉素A 和B 对单子叶植物 (稗草、马唐、莎草) 和双子叶植物 (藜、马齿苋、牛膝菊、焊菜) 具有一定的除草活性，且对苗前的除草活性要强于苗后，对水稻较为安全[10,18-19]，本文研究结果与这些研究结果一致。王世梅等研究显示，50 mg/kg (即50 mg/L) 及其以上浓度的除莠霉素A 喷施旱稗可导致植株叶片枯萎，且枯萎叶片数量随药剂浓度的增大而增加，而400 mg/kg (即400 mg/L) 的药剂处理水稻仅造成第一片叶发黄，且7 d 后症状消失，但随着浓度的增加水稻地上部分鲜重会有所降低[18]。本文研究显示，与水稻相比，即使使用1000 mg/L 的除莠霉素A 喷施玉米植株，对玉米叶片的叶绿素含量和地上部分鲜重无任何影响，说明除莠霉素A 对玉米的安全性要显著高于水稻。因此，除莠霉素A 是一种选择性除草剂，可用于玉米田间的苗后除草。