延边黄牛ANGPTL2与ANGPTL6基因多态性及其与生长性状的关联分析

孙乐凡，赵祎，王卓，张君正，戢爽

(延边大学农学院，吉林 延吉 133000)

延边黄牛是中国五大良种黄牛之一，与秦川牛、南阳牛、鲁西牛、晋南牛齐名。延边黄牛与韩牛有着似的性状与指标，有着良好的耐粗饲和遗传性能稳定的特点，肉质鲜嫩、口感细腻多汁，是我国十分优秀的肉牛品种。

血管生成素样蛋白(angiopoietin-like protein，ANGPTL)是一类与血管生成有关的基因。ANGPTL与血管生成素结构相似，但不能与血管生成素的酪氨酸激酶受体结合，表明ANGPTL家族具有不同功能。ANGPTL家族共包含8个成员，家族成员之一的ANGPTL5只在人类基因当中才能够表达，而其余ANGPTL基因家族成员是可以在其他物种(如小鼠)中表达[1]。ANGPTL具有相似结构，但是功能不同，功能差异较大。ANGPTL8是ANGPTL基因家族中的非典型成员，缺乏N端卷曲螺旋结构域和C端纤维蛋白原结构域[2]。ANGPTL在基因序列和蛋白质结构上与血管生成素极为相似，区别在于它并不与血管生成素的经典受体TIE1和TEK/TIE2结合[3-5]。人类的ANGPTL2基因定位在第9条染色体，ANGPTL6基因定位于第19条染色体[6]。ANGPTL2蛋白是一种分泌型糖蛋白，与血管生成素同源，可通过自分泌或旁分泌作用对内皮细胞发挥功能[7]。ANGPTL2基因通过激活ERK1/2信号通路部分抑制成骨细胞的分化，作为骨细胞分化的调节因子[8]，这表明ANGPTL2在成骨细胞的分化中起着不可或缺的作用。ANGPTL2在脂肪细胞中大量表达，与脂肪细胞分化的稳定性有关[2]。ANGPYL6基因被认为与葡萄糖分解代谢、胰岛素敏感度等有着某些关联[9]。ANGPTL6基因被认为是与多种疾病相关，目前主要的研究是关于治疗肥胖和糖尿病方面[10-11]，与家族性颅内动脉瘤、脂肪肝等代谢类疾病相关[12]，还参与人体血糖调节[13]。ANGPTL6与代谢和血管生成相关，推断ANGPTL6基因对于家畜的生长和疾病的预防有着重要意义。

高分辨率熔解曲线(high resolution melting，HRM)，是依赖于单核苷酸熔解温度差的不同而形成不同形态熔解曲线的一种基因解析[14]。HRM技术是一种用于SNP检测手段分析的方法，对于试验进行、基因研究、育种选育等方向有实践意义[15]。育种的根本目的是为了加强种群的生产性能，故生产性能测定属于育种过程中最基础的工作[16]。本文通过检测延边黄牛相关基因ANGPTL2、ANGPTL6多态位点，分析其对延边黄牛体尺性状是否存在影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选择延边黄牛国家核心育种场120头24月龄，饲养管理条件相同的延边黄牛母牛作为试验研究对象。分别采取颈静脉血，按6∶1的比例加入ACD抗凝剂，最终冷冻至-80 ℃备用。利用测仗、卷尺以及其他测量工具统一对母牛进行体重、体斜长、胸宽、腰角宽、髋宽、臀端宽、体高、腰高、臀端高、胸围、腹围、管围等12个生长性状指标的测定，测定方法参考NY/T 2660—2014《肉牛生产性能测定技术规范》。

1.2 主要试剂

基因组DNA提取试剂盒、HRM分析试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；2×TaqPCR Master Mix购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 基因组DNA提取与检测

首先将试验材料(120份延边黄牛血样)进行解冻，操作时依照DNA提取试剂盒的说明书严格进行。利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并使用超微量紫外分光光度计测试出其纯度与浓度。将完整的DNA样本稀释至20 ng/μL，于-20 ℃保存备用。

1.4 引物设计与合成

根据GenBank上牛ANGPTL2(登录号为：NC_037338.1)与ANGPTL6(登录号：NC_037334.1)基因序列，使用Primer Premier 5.0软件对该基因的外显子部分序列设计引物，运用Beacon Designer 7.0软件设计HRM分型引物。引物按表1交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR和HRM检测引物

1.5 PCR扩增

随机抽取30份DNA样品构建DNA混池，PCR扩增体系50 μL：2×TaqPCR Analysis PreMix 25.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA混池模板1 μL，ddH2O 22.0 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。5 μL PCR 扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶上110 V电泳30 min，取鉴定正确的PCR产物至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.6 HRM反应程序

HRM反应体系20 μL：2×HRM Analysis PreMix 10 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL，ddH2O 7.8 μL。HRM反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，49.35 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45个循环；95 ℃ 15 s，40 ℃ 60 s后升温至65 ℃持续10 s，升温过程中，温度每增加1 ℃，采集25次荧光信号。结束后用ECO软件进行数据分析。

1.7 统计分析

ANGPTL2、ANGPTL6基因与生长性状关联分析，运用SAS软件(Ver.6.12)，结合单因素方差分析和邓肯模型进行分析统计各个基因型与生长性状的相关性，P<0.05为差异显著性判断标准，结果以“平均值±标准差”表示。采用模型：Yijk=u+fysj+gi+eijk，其中Yijk为生长性状，u为群体均值，gj为基因效应，eijk为观测值对应的随机残差效应。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增

PCR扩增产物利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，与预期目的条带大小一致，并且无杂合条带，满足后续试验的要求。

M.DL2000 DNA Marker；1～3. ANGPTL2；4～6. ANGPTL6图1 延边黄牛ANGPTL6与ANGPTL2基因PCR扩增

2.2 测序验证

测序结果显示，ANGPTL2基因rs207929155位点存在T/C突变，产生C和T 2个等位基因，构成CC、CT和TT 3种基因型(图2)。ANGPTL6基因rs209550852位点发生A>G突变，构成AA、AG和GG 3种基因型(图3)。

图2 ANGPTL2基因rs207929155突变位

图3 ANGPTL6基因rs209550852突变位

2.3 HRM分型

HRM联合测序确认位点位置，基因HRM的分型结果显示存在3种熔解曲线，其中相互汇聚成一簇的为相同基因型。ANGPTL2基因分别对应着3种基因型：CC、CT和TT(图4)，ANGPTL6基因分别对应着3种基因型：AA、AG和GG(图5)。

图5 ANGPTL6 HRM分型

2.4 基因多态性分析

由表2可见，延边黄牛的ANGPTL2基因存在T/C突变位点，TT(0.533)、T(0.622)分别为优势基因型和优势等位基因。ANGPTL6基因存在A/G突变位点，AG(0.533)、A(0.656)分别为优势基因型和优势等位基因，卡方检验(χ2)结果显示出该突变位点符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。

表2 各位点基因频率和等位基因频率

遗传变异参数如表3所示，突变位点的遗传纯合度(Ho)高于杂合度(He)，有效等位基因数(Ne)较小，说明在群体中等位基因均匀分布，变异程度低，该基因的多态信息含量(PIC)为中度多态(0.25

表3 ANGPTL6 和ANGPTL2基因遗传变异参数

2.5 基因变异与延边黄牛生长性状的相关性

对120头24月龄延边黄牛的生长性状以及ANGPTL2、ANGPTL6基因突变位点的不同基因型之间进行关联分析，结果见表4、表5。ANGPTL2基因rs207929155位点携带CC基因型个体管围显著高于CT基因型(P<0.05)，其余生长性状影响均不显著(P>0.05)。ANGPTL6基因rs209550852位点携带AG基因型的个体髋宽显著高于GG基因型(P<0.05)，携带GG基因型个体臀端宽显著高于AA基因型(P<0.05)，携带AA和AG基因型个体腰高显著低于GG基因型(P<0.05)。

表4 ANGPTL2基因突变位点不同基因型与延边黄牛生长性状的关联分析

表5 ANGPTL6基因突变位点不同基因型与延边黄牛生长性状的关联分析

3 讨论

ANGPTL2是一种具有刺激炎症功能的分泌信号蛋白因子，在脂肪细胞和韧带成纤维细胞中大量表达，ANGPTL6基因是一种既与血管生成有关又与代谢、胰岛素敏感性密切相关，是由肝脏来分泌的一种蛋白肽。ANGPTL2在糖尿病、肾病的发病机制中高度参与，血清中ANGPTL2水平是糖尿病、肾病的标靶基因之一，也有研究表示其与小鼠动脉脉瓣发育相关[17]。黄牛的ANGPTL6基因存在内含子保留(intron retention，IR)的选择性剪接[18]。研究表明ANGPTL6基因的表达与动物体重的调控相关[19]。由此推测，ANGPTL2与ANGPTL6基因与动物的生长发育之间存在着相关。

已有试验证明ANGPTL2基因显著影响2型糖尿病患者血糖控制水平[20]。研究表明在小鼠中，ANGPTL2能够显著影响甘油三酯、脂肪酸在血浆中的水平，从而干扰其脂质代谢平衡[21]。对于脂质代谢平衡的影响最终会影响脂肪沉积，进而影响动物生产。ANGPTL2在梅山猪与肉鸭的胸部皮下脂肪和腹部脂肪组织中高效表达[22-23]，但在牛上还未见报道。

有研究发现，ANGPTL6基因的突变会影响动物生长发育。李爱民等[6]发现了在ANGPTL6基因上C2403A位点、T2359C和G3258T多态性位点与鲁西牛的生长性状存在关联。ANGPTL6基因(bANGPTL6)存在内含子保留的选择性剪接[18]。Legry等[24]探讨了ANGPTL6基因的遗传变异型发现，rs6511435的G等位基因与较低的血浆葡萄糖水平有关，SNP位点与生物体代谢之间相关。Wu等[18]克隆并测序了bANGPTL6基因同种型，说明其在肉牛育种计划中具有必要性。

除ANGPTL2与ANGPTL6以外，其他的家族成员也有基因多态性与生长性状关联分析。李亚星等[25]发现秦川牛ANGPTL3基因g.-38T>C和g.509A>G位点突变与秦川牛胴体重相关；而李彦宏等[26]探究家兔ANGPTL4基因第6外显子内的多态性及其与家兔部分生长性状的关联性，c.823 G>A，c.867 T>C和c.975 T>C等突变与3个品种兔生长性状相关。ANGPTL具有相似结构但是功能不同，推测其家族内其他成员可能对延边黄牛体尺性状也存在关联性，所有家族成员具有2个不同功能领域：羧基端纤维样域和一氨基末端卷曲-螺旋结构域[27]，前者有利于多聚体的形成和介导脂肪代谢[28-29]，后者介导与血管生成有关的功能[30]。

延边黄牛本身为延边地区役肉兼用牛，后经时代发展转型为肉用牛，而在这样的前提背景下延边黄牛的生长性状成为了育种选择的重要依据。综上所述，ANGPTL2与ANGPTL6基因与动物体生长发育、疾病、代谢相关。因此，对于ANGPTL2与ANGPTL6基因的研究十分必要。我们的研究结果表明ANGPTL2与ANGPTL6在延边黄牛群体中存在基因位点与生长性状的相关，对于延边黄牛育种方向有着参考意义，后续可配合延边黄牛体内外生理机制进行进一步分析。

4 结论

ANGPTL2基因rs207929155位点存在T/C突变，该位点基因型影响个体管围。ANGPTL6基因rs209550852位点存在A/G突变，基因型可显著影响延边黄牛髋宽、臀端宽和腰高。试验结果证明，ANGPTL6与ANGPTL2基因多态位点和延边黄牛的生长性状之间存在相关性，可作为延边黄牛生长选育的潜在候选基因。