中医药促进股骨头坏死血管修复与生成的研究进展*

刘子嘉,李莹,高利珍,姚耀,张沛刚,王波文,曹玉举,2

1.河南中医药大学,河南 郑州 450046; 2.郑州中医骨伤病医院,河南 郑州 450016

股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是骨科常见疑难病,后期致残率较高。据统计,中国15岁以上的非创伤性ONFH患者约812万,患病率持续增长[1],已成为备受关注的公共卫生问题。ONFH的发病可能与骨内高压、脂肪栓塞、骨内血管损害等有关,其发病机制尚未明确,但病理基础研究认为,初期为血液循环不畅,末期是血供难以维持骨组织需要,周围骨细胞、骨髓造血干细胞等发生不同程度的死亡,最终发生ONFH[2]。有学者指出,血管完整性在ONFH的自我修复中具有重要作用,可为受损骨组织提供充分的营养支持,因此,调控相关信号通路促进血管修复、生成,在早期截断ONFH病情的进展有其必要性[3]。当前研究认为,ONFH血管修复与生成主要涉及磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)/苏氨酸激酶(threonine kinase,AKT)通路、Notch通路、缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)通路、微小RNA(microRNA,miRNA)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、骨形成发生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)、炎症因子等途径。近年来,国家大力支持中医药发展,中医药疗效也逐渐被大众认可,中医药预防及早期治疗ONFH效果显著,不良反应发生率低[4]。当前研究发现,中医药可通过调控以上途径促进血管修复与生成,延缓ONFH病情进展,现将中医药促进ONFH血管修复与生成的研究进展综述如下。

1 中医药通过调控相关信号通路促进血管修复与生成

1.1 PI3K/Akt信号通路PI3K作为一组信号传导酶,被外界因素刺激后,磷脂酰肌醇肌醇环上的 3′-OH发生磷酸化改变,继而激活下游靶点发挥作用。AKT作为PI3K的直接靶蛋白,在PI3K的调节下,AKT本身及其下游多种激酶均会被激活,既往研究证实,PI3K/AKT通路在调控骨细胞增殖分化、凋亡等方面具有重要作用[5]。骨微血管内皮细胞(bone microvascular endothelial cells,BMECs)作为股骨头重要血供结构,对维护血管功能、保障骨组织血供非常重要,有学者认为,PI3K/AKT通路与BMECs的增殖分化、迁移、凋亡等过程密切相关[6]。过度使用糖皮质激素(glucocorticoids,GCs)会激活PI3K/AKT通路,抑制BMECs活力,引起骨代谢紊乱或骨细胞凋亡,而使用PI3K抑制剂则会减轻GCs的有害作用[7]。在股骨头组织缺血缺氧时,PI3K/AKT通路也会被激活,释放出大量血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和HIF-1α等,诱导BMECs增殖分化,改善组织缺血缺氧,并促进ONFH坏死组织处的血管修复,阻止病情进展[8]。近期研究发现,PI3K/AKT通路与BMSCs分泌的细胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)具有相关性,BMSCs-EV能通过PI3K/AKT通路调节BMECs自噬,影响其生物学功能[9],并且认为细胞自噬能诱导BMSCs分化为VEGF,促进血管修复与生成[10],改善ONFH的临床症状。综上,PI3K/AKT通路能够影响骨细胞增殖分化、促进血管修复、生成主要与BMECs有关,而且在ONFH发病初期,该通路会被激活,完成机体自我修复,具有正向的调节作用。

骨碎补提取物能通过激活PI3K/AKT通路增加VEGF、Runx-2、骨保护素、骨钙素等蛋白表达,促进血管修复,同时降低破骨细胞分化因子表达,抑制骨细胞凋亡,阻止激素性股骨头坏死(steroid induced osteonecrosis of the femoral head,SONFH)病情进展[5]。银杏叶提取物能通过PI3K/AKT通路改善SONFH骨组织中BMECs的凋亡和功能障碍,逆转GCs引起的血管生成抑制,提高PI3K、AKT、内皮型一氧化氮合酶等蛋白表达,并且发现随着银杏叶提取物剂量的增加,空骨陷窝率明显降低,能够延缓SONFH病情进展[6]。健脾活骨方能通过激活PI3K/AKT通路提高人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial Cells,HUVECs)中PI3K、p-Akt、细胞外信号调节激酶、c-Jun氨基端激酶等蛋白表达,同时随着该药物剂量升高,HUVECs迁移、增殖和血管腔形成能力也随之增强,认为该药物可以通过激活PI3K/AKT通路干预GCs引起的 HUVECs 损伤[11]。

1.2 Notch信号通路Notch通路是哺乳动物体内存在的一条高度保守的信号通路,可以调控BMSCs的增殖和成骨分化,同时促进骨修复。Notch通路促进血管修复与生成是当前研究热点之一,有研究发现,当阻断机体H亚型血管内Notch通路后,不仅会发生软骨缺损、骨小梁减少等成骨低下现象,还会损害血管的生长形态,而激活Notch通路后,H亚型血管内BMECs开始增殖分化,分泌高表达的Noggin蛋白,从而促进软骨细胞分泌VEGF,引导血管出芽,形成成血管-成骨耦连,促进血管再生、骨重建等[12]。Jag1作为Notch通路转录过程中的受体蛋白,广泛存在于内皮细胞中,当Jag1受体蛋白缺失时,血管发生重塑缺陷,内皮细胞不能形成良好的网状结构,BMECs迁移能力下降,Jag1蛋白表达增加,可以促进内皮细胞出芽[13]。Notch通路的配体蛋白DLL4激活Notch通路后,能防止内皮细胞过度出芽,同时又保证骨组织处有新生血管形成,使血管功能重塑[14],认为当该通路的受体及配体蛋白表达时,该通路也会被激活而产生作用。此外,Notch通路与Wnt/β-catenin通路之间可以相互作用,并诱导VEGF、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)等表达,促进造血祖细胞增殖分化为血管,为骨坏死组织提供营养支撑[15]。从以上可以了解到Notch通路作为一个正向调节通路,不仅本身会促进骨细胞、血管生长,而且其所属配体、受体蛋白也会在该通路作用下调节血管的修复与生成。

骨碎补总黄酮能通过激活Notch通路上调Notch1、Hes1等蛋白表达,促进VEGF、BMP-2等蛋白生成,构成成血管-成骨耦联,抑制ONFH的病情进展[16]。单独使用补肾活血方可以改善SONFH模型大鼠的临床症状,大鼠骨组织内血管生成增加,空腔率、脂肪组织面积下降,大鼠血清中Jag1、Notch1等蛋白表达显著降低,而在补肾活血方基础上添加Jag1/Fc融合片段后,补肾活血方的治疗作用被抑制,以上各项指标均被逆转,认为该药可以通过抑制DLL4/Notch通路对SONFH起到修复作用[14]。有学者认为,SONFH的发病和Notch3蛋白呈正相关,与PDGF、BMP-2蛋白呈负相关,活血通络汤可以抑制Notch3蛋白表达,上调PDGF、BMP-2蛋白表达,刺激SONFH血管活性增加,改善坏死组织处血供,同时诱导BMSCs成骨分化,促进骨修复[17]。

1.3 HIF-1α信号通路作为低氧反应通路,HIF-1α 对氧浓度极其敏感,在正常氧饱和浓度下难以检测出,而在低氧浓度下高表达[18]。研究发现,过度使用GCs可导致机体骨微小血管回流受阻及髓内压增高,诱导引起血液高黏滞综合征,OB缺血缺氧,最终形成SONFH[7]。此时,HIF-1α处于较高表达状态,随着OB缺氧情况的改善,HIF-1α表达也逐渐下降[19]。多数学者一致认为血管的完整性是骨组织修复的必需条件,而在缺血缺氧环境下,HIF-1α具有促进血管修复与生成的能力[20],VEGF在此过程中起着核心作用[21]。VEGF为 HIF-1α 通路下游靶点,HIF-1α在缺氧环境下可诱导VEGF表达,影响血管生成,亦可调节OB对低氧的适应,促进H型血管生长[20]。另有研究表明,HIF-1α的表达被抑制时,Notch通路的Jag2配体表达也随之下降,认为HIF-1α可以通过Jag2配体调控Notch通路,促进血管组织出芽[22]。在一项体内研究中发现,对BMSCs进行缺氧预处理后,其细胞凋亡数减少、骨增殖分化能力增强。此外,对其进行免疫学评估,发现细胞内HIF-1α和β-catenin表达均增加,VEGF、碱性磷酸酶、骨钙素等也随之增加,且有新生血管状结构形成,认为在缺氧环境下,机体可通过调节HIF-1/β-catenin通路刺激 BMSCs 分化为血管,增加骨活性[23],有助于ONFH早期治疗。近期研究发现,前列腺素E2在血管生成和骨骼修复中有重要作用,能够增强HIF-1α在常氧环境下的表达,当前列腺素E2介导的HIF-1α表达下调时,则会抑制OB增殖和血管生成[24]。综上,HIF-1α通路促进血管修复及生成与VEGF、Notch通路及其相关配体Jag2、前列腺素E2等关系密切,在缺血缺氧条件下发挥着正向调节的作用。

研究发现,SONFH患者口服自拟方生脉成骨胶囊后,血清中VEGF、HIF-1α、Toll样受体4(Toll-likereceptor-4,TLR4)等的表达显著升高,可改善缺血缺氧环境及坏死组织处的血流灌注,纠正骨代谢异常,延缓病情进展[19]。ONFH患者于髓芯减压术后口服补肾生骨方可以明显改善髋关节功能,术后1、3、6、12个月进行复查,发现血清中HIF-1α和 VEGF-A 的含量高于术前,认为补肾生骨方能够通过提高血清中HIF-1α、VEGF-A含量促使血管生成,重建股骨头血管网络,使股骨头得到充分血液供应,延缓病情进展[18]。有学者建立SONFH模型大鼠,分别以0.5 g·kg-1、1.0 g·kg-1、2.0 g·kg-1自拟方生骨再造丸灌胃,发现该方能够促进股骨头H型血管标记物股骨头内皮黏蛋白、CD31、成骨细胞特异性转录因子等的生成,且随着药物剂量升高,HIF-1α、VEGF、Runx2 mRNA等的表达也随之升高,认为该药能通过上调HIF-1α/VEGF通路促进H型血管生成,促进骨修复[20]。

2 中医药通过调控miRNA促进血管修复与生成

miRNA是一种可调节基因转录的非编码RNA分子,主要由21～25个长度的核苷酸组成。miRNA作为基因传递的天然载体,在临床治疗中表现出积极作用,比如抑制炎症反应、促进BMSCs增殖分化等[25]。有学者发现,miRNA对调节血管修复与生成既有促进作用,也有抑制作用。miR-27a与BMECs来源的外泌体相互作用后,其本身具备了促OB增殖及血管再生的能力,可以延缓SONFH病情进展,为骨修复提供条件[3]。VEGF作为miR-29b的下游靶点,其RNA 3′翻译区蛋白与miR-29b作用后,本身的促血管生成能力下降,而当抑制miR-29b表达后,本身的促血管生成能力增强,能够延缓ONFH病情进展[26]。FoxO1作为miR-135b的靶基因,可以抑制内皮细胞增殖、迁移和血管修复与生成,而表达上调的miR-135b可以逆转FoxO1抑制性,增高血清中VEGF-A、MMP-2和MMP-9的表达水平,促进HUVECs和BMECs中的细胞迁移和血管生成,治疗类固醇引起的SONFH[27]。有学者通过动物实验得出结论:miR-100-5在ONFH骨组织外泌体中表达上调,并通过调节BMP-R2/SMAD1/5/9通路抑制BMSCs的成骨能力和HUVECs的血管生成能力,促使股骨头中骨小梁变薄和破坏,而沉默miR-100-5p后能通过激活该通路挽救ONFH骨组织外泌体引起的成骨和血管生成减少[28]。从以上可以了解到miR-27a、miR-135b具有正向调节作用,miR-29b、miR-100-5具有负向调节作用,多是通过调节相关通路、分化因子及蛋白实现的。

使用地塞米松构建SONFH模型小鼠,观察到miR-206及其靶标HIF-1α在SONFH组织中表达上调,而黄芪多糖能通过下调miR-206表达,激活HIF-1α轴,促进骨细胞自噬、血管修复与生成,并抑制骨细胞凋亡,改善SONFH病情[29]。有学者建立SONFH模型大鼠,使用淫羊藿苷进行治疗,发现能够诱使SONFH模型大鼠血清中的miRNA-335过表达,并促进BMECs的血管成形能力,以提高GCs损伤后的BMECs存活率,改善坏死组织处血供[30]。后期研究发现,淫羊藿苷可调节SONFH患者BMECs中的miRNA-23b表达失衡,保护其血管生成能力,预防疾病发生,认为miRNA-23b是淫羊藿苷预防SONFH疾病发生的作用靶点[31]。

3 中医药通过调节TGF-β促进血管修复与生成

TGF-β是一种多功能细胞因子,其功能作用取决于该细胞因子所处的微环境。有学者发现,TGF-β 广泛存在于机体骨组织、血小板等区域,为骨细胞的重要调节因子。近期发现,TGF-β能促进BMECs增殖分化,在ONFH治疗期间起到血管损伤修复和重建的作用[32]。BMP-2隶属于TGF-β家族,能促进骨细胞外基质合成及BMSCs成骨分化,被应用于骨修复,在ONFH的治疗中有重要作用[2]。有研究发现,SONFH确诊患者血清中 TGF-β、BMP-2水平显著低于未确诊组,重度SONFH患者血清中TGF-β、BMP-2水平显著低于中度SONFH患者,认为可以通过观察TGF-β、BMP-2指标水平,评判SONFH病情,而在进行GCs干预实验后发现,TGF-β、BMP-2指标水平显著上升,骨组织再生修复能力上升,末梢血管循环状态明显好转[32]。后期也有学者验证了这一结果,对SONFH患者进行GCs干预治疗,发现患者股骨头组织内VEGF、TGF-β1、BMP-2 mRNA等水平逐渐上升,股骨头病理损伤明显改善,认为SONFH骨修复与血管再生可能和激活TGF-β1/BMP-2通路有关[33]。Runx2作为TGF-β和BMP的共同靶点,是调控BMSCs分化为OB的关键转录因子,有研究证明Runx2可以促进血管生成[34]。后期有学者发现TGF-β具有抑制Runx2促血管生成的作用,BMP具有促进Runx2促血管生成的作用[35]。也有学者认为,TGF-β通路与Notch、Wnt/β-catenin通路相互抑制或促进,具有调节OC、OB、血管修复等作用[36]。从以上可以了解到,调节TGF-β促进血管修复与生成的作用与BMECs、BMP、Runx2以及多种通路有关,为正向调节作用。

对ONFH患者于髓芯减压术后以骨移植物治疗,发现骨碎补总黄酮可以诱导血管形成,促进VEGF、TGF-β1、BMP-2等再生相关因子表达,升高BMP-SMAD通路蛋白(BMP-2、SMAD1、SMAD4、SMAD5和Runx2)表达,且随着骨碎补总黄酮剂量的升高,骨移植物生长和矿化的速度加快,认为这一过程与BMP-SMAD通路的激活有关[34]。酒精性ONFH在淫羊藿苷联合MMP抑制剂GM6001的共同作用下,骨坏死组织处损伤的改善最为明显,且股骨头BMP-2、TGF-β、bFGF等细胞因子水平显著上升,坏死处骨组织内的骨小梁排列、数目、厚度、血清磷、钙等均有不同程度的改善[37]。

4 中医药通过干预炎症因子促进血管修复与生成

炎症反应增加是ONFH病情进展的原因之一,ONFH患者血清中BMPs蛋白表达升高后,可减少白细胞介素(interleukin,IL)-34产生,抑制OC分化,促进血管修复与生成,延缓ONFH病情进展[38]。抗IL-6治疗可减轻髋关节滑膜炎症状和抑制破骨吸收,并促进ONFH修复期的成骨分化[39],因此,抑制炎症反应可以作为ONFH的一种治疗手段。有实验指出,ONFH患者血清中IL-33明显高于健康人群,经过治疗后IL-33水平逐渐下降,认为 IL-33 可作为预测ONFH的标志物,同时可抑制血管生成、OC生成以及促进骨吸收[40]。后期有学者证实,使用体外冲击波治疗ONFH后,患者血清中 IL-1β、IL-33、IL-17A及其受体IL-17 RA蛋白表达显著降低,血管生成能力和骨组织再生能力显著提高[41]。对ONFH患者股骨头中的微血管形成机制进行研究,发现残留的骨小梁及硬化结膜组织中存在大量炎性细胞,其中数量最多的是巨噬细胞,其次是T淋巴细胞和B淋巴细胞[42]。近期研究指出,TLR4/NF-κB通路是GCs引起ONFH的重要通路之一,激活TLR4/NF-κB通路会增加肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α释放,增加炎性反应,影响成骨生成、血管修复与再生[43]。综上,干预炎症因子促进血管修复与生成,关键在于抑制炎症因子产生,进行抗炎治疗。

通络生骨胶囊可以通过抑制TLR4通路,减少SONFH大鼠股骨头组织中骨坏死面积和空骨陷窝率,抑制NF-κB、TNF-α、MyD88、TLR4等蛋白表达,使得骨小梁逐渐粗大、规则,骨细胞形态恢复正常,出现血管重建现象[44]。使用脂多糖、IFN-γ或IL-4处理源自骨髓的巨噬细胞,诱导M1、M2样表型细胞,发现与未处理的M1巨噬细胞相比,经黄芪甲苷Ⅳ处理过的M1巨噬细胞培养基上诱导的细胞凋亡骨细胞更少,且AS-Ⅳ能降低TNF-α和 IL-1β 的水平。此外,AS-Ⅳ能通过将巨噬细胞从M1型极化为M2型,减轻炎症反应,促进骨细胞存活及血管再生,缓解ONFH临床症状[45]。双倍剂量的护骨胶囊比基础剂量能更好地降低SONFH模型大鼠股骨头关节囊内关节液TNF-α、IL-6、IL-33 含量,调节血管生成,抑制OC生成及骨吸收,防止SONFH病情的进一步发展[40]。

5 总结

ONFH的发病与治疗现已成为国际性问题,血管损坏是导致ONFH病情快速进展的重要原因,局部组织血循不畅,无法支撑骨细胞营养需要,会使骨细胞失去活性[2],因此,促进血管修复与生成对延缓ONFH病情进展有重要作用。中医药促进ONFH血管修复与生成涉及PI3K/AKT通路、Notch通路、HIF-1α、miRNA、TGF-β、BMP-2、VEGF、BMECs、炎症因子等多条途径,无论是单味中药有效提取物还是中药复方,均能通过以上途径促进血管修复与生成,延缓ONFH病情进展[6,16,19,29,37,44]。就当前研究而言,改善患处血供仍然是临床治疗的一大难题,中医药通过调控以上途径或许可以实现早期干预血管修复与生成,改善局部血供,但是单纯使用中医药治疗ONFH可能面临着服药周期长、临床效果慢、易发生肝肾功能损害等问题,建议采取中医药联合髓芯减压、打压植骨等方法共同治疗ONFH,以改善病情以及降低不良情况发生率。在未来研究中,可将中医学与和循证医学相联合,在对ONFH辨证论治的同时,结合现代科学理论进行分析,为中医药治疗ONFH提供客观、可重复的理论依据。