中国北方3-羟基异戊酰肉碱异常患儿代谢及遗传分析

张万巧 闫 磊 朱丽娜 马秀伟

中国人民解放军总医院第七医学中心儿科医学部 1.儿科研究所，2.儿内科，3.出生缺陷防控关键技术国家工程实验室，4.儿童器官功能衰竭北京市重点实验室（北京 100700）

基于串联质谱（tandem mass spectrometry，MS/MS）的酰基肉碱分析可用于辅助诊断有机酸血症、脂肪酸氧化异常等多种遗传代谢病[1]（inherited metabolic diseases，IMD）。参与支链氨基酸及奇数碳脂肪酸代谢的多种羧化酶功能障碍导致体内3 羟基异戊酰辅酶A 和3 羟基2 甲基丁酰辅酶A 的累积，二者通过肉碱酰基转移酶酯化为3 羟基异戊酰肉碱（3-hydroxyisovalerylcarnitine，C5OH）[2]。据报道C5OH 是筛查多种羧化酶缺乏（multiple carboxylase deficiency，MCD）、3-甲基巴豆酰辅酶A 羧化酶缺乏（3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency，3MCCD）、3 羟基3 甲基戊二酸尿症（hydroxymethylglutaric aciduria，HMGA）、β-酮硫解酶缺乏（beta-ketothiolase deficiency，BKT）等多种疾病的有效标志物，在新生儿筛查中得到广泛应用[3]。由于C5OH 相关疾病众多，临床表现及干预治疗差异巨大，如何快速有效地对筛查异常患儿进行鉴别、诊断十分关键。为探讨中国北方临床高危儿中C5OH 指标的异常情况及对后续诊断的贡献，本研究综合利用基于MS/MS、气相质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）的 代谢分析以及基于外显子组测序的遗传分析，通过研究C5OH 异常患儿的疾病谱、代谢表型与变异基因型的关系，以期为优化临床诊断及干预决策提供参考和依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2012年11月至2021年10月中国人民解放军总医院第七医学中心所有行MS/MS 筛查的0～7岁住院患儿的临床资料。

本研究获得患儿家长的知情同意和医院伦理委员会的批准（No.2018-1）。

1.2 方法

1.2.1 血/尿遗传代谢病筛查 干血斑样本采用非衍生化的方法，在Xevo TQD 串联质谱系统（美国Waters 公司）上，使用氨基酸和脂酰肉碱同位素内标NSK-A、NSK-B（美国剑桥同位素实验室）进行检测分析[4]。对初检阳性患儿进行召回，重新采血样复查酰基肉碱谱并接受尿液GC-MS 检测。尿液样本采用尿素酶前处理，经三甲基硅烷衍生化通过TRACE GC ULTRA-ISQ 气相色谱质谱仪（美国Thermo Fisher 公司）进行分析[5]；尿素酶、甲基硅烷化试剂BSTFA+TMCS(99:1)为美国Sigma 公司产品。所用化学试剂为色谱级纯的甲醇、甲酸（美国Fisher Scientific 公司），分析级纯的丙酮、正己烷、无水乙醇（北京化工厂）。质谱检测各代谢物指标的切值，参考国家临检中心2019 版专家共识[6]，结合本实验室质控优化确定[7]。指标检测结果超出切值上限或下限之外的认定为指标异常（升高或降低）。在疾病判断时，某指标异常直接提示某种IMD 的被归为筛查该病的主要指标；某指标异常与某种IMD 相关，但需与主要指标结合才能做出判断的被归为次要指标[8]。

1.2.2 基因变异分析及诊断标准 采集患儿及其父母EDTA 抗凝外周血，提取血液基因组DNA。采用Nimblegen 全外显子芯片进行捕获，利用Illumina Hiseq 测序平台进行高通量测序分析（北京智因东方转化医学研究中心）。所得疑似致病变异采用Sanger 测序验证，并参考美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）分类标准对可疑变异进行致病性评估[9]。患者在同一致病基因上存在纯合或复合杂合变异，且变异评估为“致病或可能致病”，结合血、尿代谢筛查结果及临床表现给予诊断[10-11]。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析。计数资料以例（%）表示。非正态分布计量资料以中位数M（P25～P75）表示。

2 结果

2.1 血/尿样本代谢分析结果

共检测患儿53 119 例，检测年龄3.0（2.0～3.7）天，男31 087 例、女22 032 例，男女比例1.41:1.53 119 例患儿中检出C5OH 增高48 例，其中伴有其他指标升高的共12 例，包括：单伴3-羟基丁酰肉碱（3-hydroxybutyryl carnitine，C4OH）升高4 例，单伴丙酰肉碱（propionyl carnitine，C3）升高4 例，同时伴C4OH、C3 升高2 例，同时伴甲基巴豆酰肉碱（methyl butyl carnitine，C5:1）、C4OH 升高2例。通过尿液GC-MS 检测，其中9 例检出C5OH相关疾病代谢异常，生化诊断为有机酸血症：包括MCD 4 例（血中C5OH、C3 同时增高），MCD 或3MCCD 2 例（血中仅见C5OH 升高，但部分MCD病例C3 可正常），BKT 2 例，HMGA 1 例。

2.2 患者血酰基肉碱水平分析

生化诊断IMD 的9 例患儿的异常酰基肉碱水平分析见表1。C5OH 指标在其余未诊断的53 110 例住院患儿干血斑样本中的检测浓度为0.13（0.10～0.18）μmol/L；在2 例诊断BKT（ACAT1变异）的患儿中仅轻度升高（平均浓度为切值上限的1.5倍），且同时伴有C5:1、C4OH 升高；在6 例诊断MCD（HLCS或BTD变异）的患儿中显著升高（平均浓度为切值上限的9.6 倍）；4 例（66.7%）伴C3升高；其中2 例（33.3%）还同时伴有C3/乙酰肉碱（C2）升高。

表1 各基因型诊断病例的血液酰基肉碱分析结果(μmol·L-1）

2.3 确诊患者基因检测结果

提示MCD 的4 例患儿中，2 例检出HLCS变异，确诊为全羧化酶合成酶缺乏（holocarboxylase synthetase deficiency，HLCSD）；2 例检出BTD变异，确诊为生物素酶缺乏（biotinidase deficiency，BTD）。提示BKT 的2 例均检出ACAT1变异；提示HMGA的1 例检出HMGCL变异。生化诊断未分型疑似MCD 或3MCCD 的2 例，1 例检出HLCS 变异，另1 例检出BTD变异，最终确诊MCD。

9 例患儿的基因诊断均与生化诊断相符，MCD或3MCCD 的6 例患儿的变异检出情况见表2，共检出2 种变异基因，5 例为复合杂合，1 例为纯合；共检出9 种变异型，其中3 种为新发现的，分别为c.1313delC（HLCS）、c.172T＞C（BTD）、c.491dupG（BTD）。HLCS病例1 和3 为满族、同胞姐弟。

2.4 代谢指标诊断效率

本研究干血斑MS/MS 检测中C5OH 单一指标筛查阳性率0.090%（48/53119），最终诊断IMD 9 例，阳性检出率1: 5902，假阳性率0.073%（39/53110），阳性预测值18.75%（9/48）；C5OH 合并多指标（C4OH、C3、C5:1）筛查阳性率0.022%（12/53119），其中7例确诊，假阳性率0.009%（5/53110）显著降低，阳性预测值升高（58.33%，7/12）。另一血筛主要指标C5:1 在53 119 例住院儿中升高的例数为92例，筛查阳性率0.173%，高于C5OH，但C5OH合并C5:1 升高仅2 例，且后续均确诊为BKT，阳性预测值达100%。C5OH 异常患儿召回复查并行GC-MS 检测时，C5OH 升高合并尿代谢物异常9 例，后续全部确诊，无一假阳性，阳性预测值100%。

3 讨论

基于MS/MS 的IMD 筛查指标的设置既要尽量避免阳性患儿的漏诊、误诊，又要将阳性召回率、假阳性率控制在可接受的范围，以避免不必要的入院、检查、随访以及家属的焦虑。目前关于MS/MS 筛查指标的阳性率、假阳性率以及阳性患儿疾病谱等，国内鲜见报道。C5OH 是MS/MS检测的重要指标，已列入包括我国在内的多个国家、地区的新生儿IMD 筛查项目[12]。由于该指标与MCD 等多个有机酸血症相关，仅凭单一指标难以实现分型鉴别。另外，严重感染、脑梗、脑出血、早产、营养不良等因素也可继发血中C5OH 的增高[13-14]，造成假阳性的增加[15]。目前，可利用临床表现、GC-MS 尿代谢谱分析、酶学检测和基因分析等多种手段来实现后续的确诊。为考察C5OH 指标的诊断效能，以及如何综合利用各手段以优化诊断程序，本研究在53 119 例0～7 岁的高危儿中进行了为期9 年的观察，发现C5OH 单一指标的假阳性率为0.073%，阳性预测值为18.75%。与梅奥医学实验室提出的MS/MS 新生儿筛查指标的推荐要求（假阳性率＜0.3%，阳性预测值＞20.0%）[16]大致相当。本研究利用C5OH 合并多指标C4OH、C3、C5:1 综合分析，可显著降低假阳性率，并提高阳性预测值，C5OH 合并C5:1 升高确诊BKT 的阳性预测值达100%。

尿GC-MS 代谢分析是降低MS/MS 筛查假阳性的重要手段。本研究在对C5OH 异常患儿采血复查的同时，采集尿样进行GC-MS 检测。通过血、尿代谢谱综合分析，生化诊断IMD 9 例。其中7 例，包 括4 例MCD、2 例BKT、1 例HMGA 可根据异常代谢物明确分型；另外2 例疑似诊断MCD 或3MCCD，未得到分型。后续对9 例生化诊断病例，利用全外显子组测序技术进行遗传分析，2 例疑诊病例均明确为MCD；全部遗传诊断结果均与生化诊断相符。血MS/MS 联合GC-MS 尿检测可生化确诊HMGA、BKT 等疾病；且后续基因测序验证中，未出现假阳性病例，阳性预测值高达100%。本研究未观察到MS/MS 筛查阴性患儿出现C5OH 相关IMD 的疑似症状。由于随访时间较短，难以获得筛查阴性患儿的基因信息，存在缺乏筛查假阴性相关结果等局限。

本研究中C5OH 代谢异常的主要疾病类型为MCD。MCD 是由于患者不能利用生物素所导致的可引发包括神经系统在内的多系统异常的有机酸血症，包括HLCS和BTD两种基因变异类型[16]。根据基因分析，本研究中HLCS和BTD缺陷占C5OH异常病因的66.7%（各为33.3%）。上述结果与南方浙江地区针对新生儿人群的发现不同。浙江新生儿筛查的C5OH 异常病例除3MCCD 外，未检出其他疾病类型，致病主要遗传原因为MCCC1、MCCC2基因变异[17]。本研究结果提示了中国北方C5OH异常患儿的遗传特点，并在此基础上发现了MCD相关的3 种新变异型：HLCS（c.1313delC）、BTD（c.172T＞C）和（c.491dupG）。

本研究结果显示MS/MS 筛查单一指标异常存在较高的假阳性，可通过结合多指标联合分析、GC-MS 尿代谢检测以及遗传分析降低假阳性率，提高诊断特异性和准确性。MS/MS 联合GC-MS 的血尿代谢分析可快速、有效获得C5OH 相关异常的生化诊断，于明确分子诊断前及时指导临床干预。基因检测对鉴别HLCSD、BTD 等类型，以及后续进行遗传咨询、产前诊断仍具有重要意义。