内源性Ghrelin对重症急性胰腺炎大鼠的保护作用及机制*

王统华, 覃月秋, 黄美英, 易廷庄, 胡高裕

(右江民族医学院附属医院 消化内科, 广西 百色 533000)

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一种常见的临床疾病,起病急、进展快、进程中容易出现多种并发症且死亡率高,重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)还可能引起除胰腺外全身系统炎症反应,甚至可能导致器官衰竭,预后危险[1]。近年来,AP的死亡率也逐渐增多,各种炎症介质、细胞因子以及激素等因素在SAP的发生发展中都有参与。Ghrelin是生长激素促分泌素受体 (growth hotmonese cretagogue receptor,GHS-R)的内源性配体,是最近发现的具有多种生物功能的含28个氨基酸的小分子肠道肽,当Ghrelin与其GHS-R结合后,具有刺激垂体前叶释放生长激素,增加食欲,调节能量代谢平衡以及促进胃酸分泌等生物学功能,但其作用机理目前尚不清楚[2-4],有研究表明Ghrelin可能参与AP的发生发展过程[5-6]。 此外,血清淀粉酶、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-a,TNF-α)和核因子(nuclear factor κB,NF-κB)也可能参与在AP的病程中[7-8]。在本研究中,通过注射牛磺胆酸钠复制AP动物模型,同时建立GHS-R拮抗组进行实验验证,观察模型大鼠的血清蛋白、Ghrelin的表达水平以及其与反映AP严重程度的参数、炎症因子和氧化应激的关系,并测量了IL-6和TNF-α的表达水平,报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 选择48只10～12周龄健康大鼠(SPF级),体质量200～235 g,由右江民族医学院提供。

1.1.2试剂及仪器 5%的牛磺胆酸钠(Simga公司),10%水合氯醛,Ghrelin(上海博宏生物科技有限公司);微量注射器、电泳槽、全自动酶标仪Multiskan MK3(美国伯乐生命医学产品上海有限公司),RT-PCR仪(Bio-Rad公司),JEM-2100F扫描透射电子显微镜(日本电子株式会社),凝胶成像系统(英国基因技术有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1动物分组与造模 随机将48只大鼠随机分为对照组、模型组、治疗组及拮抗组,每组12只。实验前所有动物在同一环境、昼夜交替喂养7 d,术前常规禁食12 h,10%水合氯醛按照0.3 mL/100 g剂量腹腔注射麻醉。模型组大鼠选择大鼠腹部没有血管的区域对胰胆管进行穿刺,按逆行方向注射5%的牛磺胆酸钠诱发大鼠SAP[9]。对照组大鼠处理方式与模型组一致,但不注射牛磺胆酸钠。治疗组大鼠:于制模后1 h给予腹腔注射Ghrelin。拮抗组:在制模前30 min给予腹腔注射生长激素释放肽(Growth hormone releasing peptide,GHRP-6),制模后1 h再腹腔注射Ghrelin。如果过程中出现大鼠因胰腺炎程度过重而未能存活的情况,应重新选择大鼠进行SAP造模补充。

1.2.2样本提取 (1)各组大鼠均在麻醉后2 h心脏取血,留样标注;(2)心脏取血后处死大鼠,收集胰腺组织,称重并计算胰腺质量指数;部分组织经PBS洗涤后,用4%多聚甲醛固定,其余组织被储存在液氮用于后续指标测量。

1.2.3血清淀粉酶、IL-6、TNF-α、NF-κB检测 采用酶联免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法测定各组大鼠血清淀粉酶、IL-6、TNF-α、NF-κB的表达水平。

1.2.4胰腺IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA表达水平 采用实时定量荧光PCR法测定,从各组大鼠的胰腺组织中提取mRNA,逆转录获得cDNA,采用SYBR Advantage Real-timePCR Premix 试剂盒进行荧光定量反应,检测各组大鼠胰腺IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA表达水平。

1.2.5胰腺组织病理检查及病理评分 将上述经PBS洗涤后固定在4%多聚甲醛的胰腺组织取出切片、脱水、染色、冲洗封片之后,在光学显微镜下观察胰腺组织病理学形态,并根据胰腺组织病理评分标准进行病理学评分。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 胰腺质量指数

与对照组相比,模型组胰腺质量指数升高,差异具有统计学意义(P<0.05),表明大鼠AP时胰腺明显肿大;与模型组相比,治疗组胰腺质量指数减少,差异具有统计学意义(P<0.05),表明Ghrelin可以改善胰腺炎大鼠的胰腺肿大;与治疗组相比,拮抗组胰腺质量指数升高,差异具有统计学意义(P<0.05),表明GSH-R拮抗可影响Ghrelin对胰腺炎大鼠的治疗效果。见图1。

注：(1)与对照组比较,P<0.05;(2)与模型组比较,P<0.05;(3)与治疗组比较,P<0.05。

2.2 血清淀粉酶、IL-6、TNF-α及NF-κB表达

检测结果(图2)显示,与对照组相比,模型组的大鼠血清淀粉酶、IL-6、TNF-α及NF-κB表达水平均有明显升高(P<0.01);与模型组相比,治疗组血清淀粉酶、IL-6、TNF-α及NF-κB表达水平明显降低(P<0.01);与治疗组相比,拮抗组血清淀粉酶、IL-6、TNF-α、NF-κB表达水平明显升高(P<0.01)。

2.3 胰腺组织IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA表达

4组胰腺组织IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA的表达结果显示(图3),与对照组相比,模型组的IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA的表达量有明显升高(P<0.01);与模型组比较,治疗组IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA的表达量都明显降低(P<0.01);与治疗组比较,拮抗组IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA的表达量有明显升高(P<0.01)。

注：(1)与对照组比较,P<0.01;(2)与模型组比较,P<0.01;(3)与治疗组比较,P<0.01。

2.4 胰腺组织病理变化及病理评分

由图4可见,对照组大鼠的胰腺可见胰腺细胞结构正常,血管纹理清晰,无水肿坏死;模型组大鼠的胰腺间质浸润,出现组织坏死及多处出血灶;治疗组胰腺间质水肿,炎症细胞浸润,胰腺轻度炎症;拮抗组胰腺组织出现出血灶,坏死水肿。评分见表1。

表1 各组大鼠胰腺组织病理评分结果

注：A:对照组;B:模型组;C:治疗组;D拮抗组

3 讨论

SAP是一种病情严重的急性炎症性疾病,目前占所有胰腺炎病例的2%[10]。许多关于SAP的研究发现,体内的各种炎症介质和细胞因子参与了SAP的发展,并且是一个持续的发展过程。目前已知的与胰腺炎有关的炎症因子有血清淀粉酶、IL-6和TNF-α等[11]。有文献报道,Ghrelin可以抑制炎症反应期间的炎症反应因子的释放[12]。在一项关于AP的临床研究中,Dembinski等[13]分别用雨蛙素及脂多糖诱导急性水肿性胰腺炎(AEP)和急性坏死性胰腺炎(ANP),发现在AP发病24 h后血清Ghrelin水平开始上升,ANP组的Ghrelin水平高于AEP组,提示Ghrelin可以作为判断AP严重程度的标志物之一。

淀粉酶水平是诊断急性胰腺炎最常用的生化标志物[14],而IL-6和TNF-α是诊断和预后SAP的重要标志物。TNF-α与各种炎症反应的发生密切相关[15]。当体内TNF-α水平升高时,可刺激炎症细胞产生各种组织损伤因子,从而促使胰腺炎的发生,也成为诊断胰腺炎的重要标志物之一。本实验证实了大鼠SAP模型的成功制备以及内源性Ghrelin对SAP治疗的影响,表现为血清淀粉酶水平的明显增加和TNF-α水平的变化。

IL-6是一种细胞因子,在全身性炎症反应中起着关键作用,在AP进程中,体内IL-6水平明显增高,而过多的IL-6存在会刺激机体产生大量的抗体,引起细胞有害毒效应,高水平IL-6可以和TNF-α协同作用,产生微循环血凝块,损害身体,导致全身多器官损害反应[16-17]。因此,IL-6水平的升高与SAP的严重程度密切相关,IL-6已成为研究SAP疾病进展的一个重要标志物。本研究再次证实了SAP造模成功以及内源性Ghrelin在治疗SAP方面的功效。

NF-κB是AP发展的一个重要标志物,是许多炎症因子(如TNF-α)的启动剂[18],抑制NF-κB可能有效地减缓SAP的进展。本研究表明,与对照组比较,模型组的NF-κB明显升高,在治疗组被Ghrelin抑制,其表达也有所下降;与治疗组比,拮抗组NF-κB表达有增高,表明GSH-R抑制了Ghrelin因子的表达,导制其无法发挥抗炎作用。NF-κB的表达水平和内源性Ghrelin对SAP治疗的影响,证实了SAP模型制备的成功以及Ghrelin在治疗SAP方面的作用。

综上所述,本研究采用5%牛磺胆酸钠成功制备大鼠SAP模型,发现内源性Ghrelin对模型大鼠的胰腺功能有明显的改善,在Ghrelin治疗下,炎症因子IL-6、TNF-α、NF-κB的表达水平明显得到抑制,降低了炎症因子mRNA的表达,从而降低炎症对机体的损害,达到对大鼠胰腺的保护作用,为今后Ghrelin对SAP的治疗奠定了实验基础和理论依据。