胭脂萝卜RsCHS1 基因克隆及表达分析

王川艺，黄红涛，陈发波，郑张飞，方 平

（1.重庆三峡学院 生物与食品工程学院，重庆 404100；2.长江师范学院 现代农业与生物工程学院，重庆 408100）

胭脂萝卜（Raphanus sativusL.）是十字花科（Cruciferae）萝卜属（Raphanus）萝卜种下的一个地方特色品种[1]，富含丰富的天然色素萝卜红色素。萝卜红色素因无毒、无污染等特点，被广泛应用于食品、化妆品等领域，是被我国允许使用的天然着色剂之一[2]。花青素是类黄酮化合物，查尔酮合成酶（CHS）是类黄酮类次生代谢生物合成途径中的第1个关键酶。改变植物体内CHS的表达量能够明显影响花青素的积累[3]。目前，已经在藤茶[4]、红花檵木[5]、灰毡毛忍冬[6]、金柑[7]、君子兰[8]、红花[9-10]、谷子[11]等植物中成功克隆CHS基因，并对其功能进行了验证。徐靖等[12]在研究甘薯CHS基因与花青素含量的相关性时发现，不同紫肉甘薯中花青素含量与CHS基因表达水平呈正相关。梁先利等[13]克隆了陆地棉的CHS基因，结果发现，陆地棉的CHS基因在纤维的色泽形成以及花青素的积累过程中起到重要的作用。多数植物中，CHS都是以多基因家族的形式存 在 的[14]，沉 香 中 有11 个CHS[15]，烟 草 中 有5个CHS[16]，刺葡萄中有2 个CHS[17]，龙眼中8 个CHS[18]。此外，CHS基因在植物不同组织和器官中的表达模式不同[19-21]，受不同环境因子影响，表达模式也存在差异[22-23]。在葡萄[24]和水稻[22]等植物中过表达CHS基因，能够提高植物的抗性。沉默CHS基因，能够改变海棠花的颜色[25]，证明了查尔酮合成酶与花青素的合成紧密相关。赖恭梯等[17]研究发现，刺葡萄CHS2 和CHS3 蛋白均为亲水性蛋白，均无信号肽，为稳定蛋白，还发现CHS启动子具有光激素响应元件、转录因子、植物生长发育和激素应答的关键顺式作用元件。WU 等[23]研究表明，茄科里面8种植物的CHS分布较为保守，但变异较小。研究发现，物理伤害白木香5个月后，会引起CHS急剧上调，是对照组的600 倍，证明了CHS在植物防御反应调控方面具有重要的作用[26]。在萝卜CHS基因研究方面，陈发波等[27]研究表明，萝卜肉质根色素含量与CHS基因表达量呈显著正相关，CHS基因可以作为萝卜高色素含量品种选育的候选基因。SONG 等[28]分析了胭脂萝卜肉质根花青素积累的转录组学动态变化，结果发现，从苗期到盛花期，RsCHS基因在肉质根的不同生长阶段显著上调，这与在发育过程中胭脂萝卜肉质根花青素分布的动态变化一致。GAO等[29]通过基因组注释和分析得到7 个萝卜RsCHS基因，说明萝卜CHS也是多基因家族。尽管关于植物花青素生物合成关键基因CHS的分子生物学研究较多，但是关于RsCHS调控胭脂萝卜大量积累色素的分子机制尚不清楚。为此，以肉质全红的胭脂萝卜为材料，克隆RsCHS1基因，利用生物信息学技术分析RsCHS1 蛋白理化性质、结构和功能；并构建RsCHS1的过表达载体，通过农杆菌介导法转入拟南芥，验证RsCHS1基因功能，以期为解析胭脂萝卜大量积累色素分子机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试材料为胭脂萝卜自交系HX1，由长江师范学院萝卜课题组提供。

1.2 总RNA提取及第一链cDNA合成

采用Plant RNA Kit（200）试剂盒（OMEGA BIO TEK 生物公司）提取胭脂萝卜肉质的总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA，利用核酸蛋白检测仪（NanoDrop One，Gene Company，USA）测定总RNA 的质量及浓度。采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 试 剂 盒（K1622，Thermo Fisher Scientific，中国）进行反转录，具体步骤参照说明书。

1.3 RsCHS1基因克隆

通过胭脂萝卜RNA-Seq 测序以及De-novo 组装，对花青素合成途径关键基因进行注释及分析，发现7个CHS基因，通过差异基因表达分析，筛选得到了显著差异表达候选基因RsCHS1基因MF182893-2和RsCHS065380-1[29]。根据2 个基因的CDS 序列设计重组引物，设计实时荧光定量PCR 引物，引物序列见表1。PCR 程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延伸70 s，共32 个循环；再72 ℃延伸5 min。扩增产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检测，采用TIANgel Midi Purification Kit试剂盒（Themo Fisher Sciemtific）进行PCR 产物纯化。将纯化产物与pBMI16A-TOPO 载体（Takara）连接，转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞（博迈德生物有限公司），进行PCR 鉴定。将阳性菌落送重庆擎科兴业生物技术有限公司进行测序。

表1 研究中所用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.4 生物信息学分析

用NCBI 数据库（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列查询。用NCBI ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分 析RsCHS1基因的开放阅读框（ORF）。用ClustalW（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）和MEGA 7进行序列同源比对和进化树构建。用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl?page=npsa-sopma.html）和SWISS MODEL（https：//www.expasy.org/）分别预测RsCHS1家族基因蛋白质的二、三级结构。用InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）分析蛋白质结构域。用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分 析RsCHS1基因编码的蛋白质跨膜区，用SignalP-4.1（SignalP 4.1-DTU Health Tech-Bioinformatic Services）对信号肽进行预测分析，用ProtScale（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl?1）和ExPASy ProtParam tool（https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）分析其疏水性/亲水性。

1.5 实时荧光定量PCR

采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix 试剂 盒（QPK-201，Beijing Solarbio Science &Technology Co.，Ltd.，中国）进行实时荧光定量PCR反应。分别提取胭脂萝卜的营养期叶、肉质根肉质和肉质根皮，花期荚果、花、肉质根肉质的总RNA，反转录得到第一链cDNA，以RsRPⅡ为内参基因设计内参引物（表1），检测RsCHS1在胭脂萝卜不同组织部位的表达情况。荧光定量PCR 反应体系：2×SYBR Green Realtime PCR Master mix 5 μL，引 物1 μL，cDNA 模板3 μL，ddH2O 1 μL。反应程序：95 ℃预热10 min；95 ℃高温变性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，共40 个循环。用2-△△Ct法进行数据处理，实时荧光定量PCR进行4次重复。

1.6 转基因阳性植株筛选与鉴定

1.6.1RsCHS1过表达载体构建 用ClonExpress ⅡOne Step Cloning Kit（Vazyme 公司）将线性化载体pBMI16A-TOPO（Takara）和 引 物CHS1-aF/R 和CHS1-bF/R 扩增得到的目的基因分别连接。重组体系（总体积20 μL）：线性化载体2 μL，目的基因1 μL，5×CE ⅡBuffer 4 μL，Exnase Ⅱ2 μL，ddH2O 11 μL。混匀后，37 ℃30 min，反应结束后立即置于冰上。采用冻融法转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，转化成功后提取重组质粒进行PCR 检测和酶切验证。将阳性质粒转入农杆菌中，菌液配制成侵染液（现用现配）。

1.6.2 花序浸染法转化拟南芥 在恒温22 ℃左右、16 h/8 h（光/暗）周期、相对湿度50%～60%条件下种植拟南芥，开花后通过花序浸染法转化拟南芥。侵染后的拟南芥避光培养24 h，7 d 后进行二次转化，收集成熟的种子记作T0，放4 ℃冰箱保存。

1.6.3 转基因阳性植株抗性筛选 取T0代转基因拟南芥种子消毒之后播种于含有Kana抗生素的MS培养基中；选取生长健壮、叶片绿色的拟南芥移载至培养基质中，置于拟南芥培养箱培养；采取相同方法进行抗性筛选直至T3代植株全部为绿色抗性植株，获得转基因拟南芥纯合植株。

1.6.4 转基因阳性植株PCR 鉴定 利用DNA 快速提取法提DNA：取适量转基因拟南芥和野生型拟南芥材料于离心管中，加入50 mL BRDA 溶液后快速捣碎叶片，95 ℃孵育10 min，加入50 mL BRDA 溶液颠倒混匀。以载体中携带的GFP 荧光蛋白设计引物（表1），分别以转基因和野生型拟南芥植株的DNA 为模板，进行PCR 鉴定。反应体系如下：2×Taqmaster mix 10 μL，上游引物GFPF 1 μL，下游引物GFPR 1 μL，DNA 2 μL，加ddH2O至20 μL。反应条件：94 ℃3 min；94 ℃30 s，58 ℃1 min，72 ℃30 s，33个循环；72 ℃10 min。

1.7 统计分析

用Excel 进行数据整理，用DPS 软件对RsCHS1在胭脂萝卜不同组织部位的表达情况进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 胭脂萝卜RsCHS1的ORF序列分析

利用不同引物在胭脂萝卜肉质根肉质中扩增得到2 个目的基因（图1），将长度约1 100 bp 的条带，命名为RsCHS1-a，长度约1 200 bp 的命名为RsCHS1-b。将2 个目的基因用试剂盒纯化后连接载体，转入大肠杆菌，挑取阳性菌落测序，结果表明，RsCHS1-acDNA 序列长度为987 bp，RsCHS1-bcDNA序列长度为1 017 bp。

利用NCBI ORF finder 预测RsCHS1基因的ORF，结果发现，胭脂萝卜RsCHS1-a基因的cDNA序列包含40 bp 的5′ 端非翻译区，184 bp 的3′端非翻译区，其最大ORF为765 bp，编码一个含254个氨基酸的蛋白质。萝卜RsCHS1-b基因的cDNA 序列包含40 bp 5′端非翻译区，14 bp的3′端非翻译区，其最大ORF 为966 bp，编码一个含321 个氨基酸的蛋白质。

2.2 胭脂萝卜RsCHS1蛋白理化性质分析

RsCHS1-a可编码由254 个氨基酸组成的蛋白质序列，相对分子质量（MV）为27 164.27，分子式为C1212H1939N323O363S10，理论等电点为5.27，负电荷残基数（Asp+Glu）为32，正电荷残基数（Arg+Lys）为24，脂溶系数（AI）为99.8，蛋白质总平均亲水性（GRAVY）为0.109，不稳定指数（II）为26.99，预测该蛋白质较为稳定。RsCHS1-b可编码321 氨基酸组成的蛋白质序列，相对分子质量（MV）为34 586.91，分子式为C1542H2465N411O459S15，理论等电点为5.43，负电荷残基数（Asp+Glu）为41，正电荷残基数（Arg+Lys）为32，脂溶系数（AI）为96.57，蛋白质总平均亲水性（GRAVY）为0.052，不稳定指数（II）为33.9，显示该蛋白质也较稳定。

TMHMM 2.0分析表明，RsCHS1-a和RsCHS1-b蛋白跨膜螺旋数量为0，推测RsCHS1-a和RsCHS1-b 没有跨膜结构域，既不是膜受体，也不位于膜上。疏水性/亲水性分析结果（图2）表明，RsCHS1-a 的最大值均为2.422，最低值均为-2.211，RsCHS1-a 蛋白中疏水性氨基酸含量高，为疏水性蛋白。RsCHS1-b的最大值均为2.422，最低值均为-2.489，RsCHS1-b 蛋白中亲水性氨基酸含量高，为亲水性蛋白。根据SignalP-4.1预测结果（图3），S得分小于0.5，推测RsCHS1蛋白无信号肽。

图2 胭脂萝卜RsCHS1基因编码蛋白质的疏水性/亲水性分析Fig.2 Hydrophobicity/hydrophilicity analysis of proteins encoded by RsCHS1 genes in red radish

图3 RsCHS1蛋白信号肽预测Fig.3 Prediction of RsCHS1 protein signaling peptide

2.3 胭脂萝卜RsCHS1蛋白二、三级结构预测

RsCHS1-a 蛋白二级结构预测结果显示，α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲和延伸链占比分别为42.13%、8.27%、31.50%和18.11%；RsCHS1-b 蛋白二级结构预测结果显示，α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲和延伸链占比分别为42.99%、7.17%、33.96%和15.89%（图4A）。α-螺旋是胭脂萝卜RsCHS1 蛋白最主要的结构元件，β-折叠和无规则卷曲分布于整个蛋白质中（图4B），表明该基因编码蛋白质的三级结构与其二级结构预测结果相符。

2.4 胭脂萝卜RsCHS1蛋白结构域分析

蛋白质结构域分析结果表明，RsCHS1-a 蛋白在N 端1—92 位氨基酸之间有1 个CHS特异位点（编号IPR001099），在C 端103—252 位氨基酸之间有1 个CHS特异位点（编号IPR012328），属于聚酮合成酶超家族成员和硫解酶同源超家族成员，说明该基因为CHS基因。RsCHS1-b 蛋白在N 端1—159位氨基酸之间有1 个CHS特异位点（编号IPR001099），在C 端170—320 位氨基酸之间有1 个CHS特异位点（编号IPR012328），属于聚酮合成酶超家族成员和硫解酶同源超家族成员，说明该基因为CHS基因。

2.5 胭脂萝卜RsCHS1家族基因蛋白质序列同源性分析与系统进化树构建

通过多序列比对分析（表2），发现RsCHS1-a蛋白序列与NCBI 上其他物种CHS 蛋白序列有较高的相似性，为82%～99%，其中，胭脂萝卜RsCHS1-a 蛋白序列与十字花科其他植物CHS 蛋白序列同源性较高，为97%～99%。RsCHS1-b编码的氨基酸序列与NCBI 上其他植物的CHS 蛋白序列有较高的相似性，为85%～99%。其中，胭脂萝卜RsCHS1-b 蛋白序列与十字花科其他植物CHS 蛋白序列同源性较高，为98%～99%。由此说明RsCHS1家族基因在十字花科植物中相对保守。

表2 RsCHS1编码的氨基酸序列与其他物种CHS蛋白同源性分析Tab.2 Homology analysis of the amino acid sequence encoded by RsCHS1 compared to CHS proteins of other species

将RsCHS1-a 和RsCHS1-b 蛋白序列及从NCBI中获取的其他植物CHS 蛋白序列进行系统进化树分析，发现系统进化发育关系与序列同源性分析结果一致，萝卜RsCHS1 蛋白与油菜、甘蓝、芜青等十字花科植物的亲缘关系较近，与水稻和葡萄的亲缘关系较远，由此推测胭脂萝卜RsCHS1基因家族蛋白与十字花科CHS基因家族蛋白具有相似的功能（图5）。

图5 RsCHS1家族基因的系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of RsCHS1 gene family

2.6 胭脂萝卜RsCHS1家族基因表达模式分析

qRT-PCR 分 析 结 果 如 图6 所 示，RsCHS1-a基因在胭脂萝卜不同部位表达量大小依次为营养期肉质根皮质（32.4）、营养期肉质根肉质（26.8）、花期花（6.7）、营养期叶（1.0）、花期荚果（0.4）和花期肉质根肉质（0.1），RsCHS1-b基因表达量大小依次为营养期肉质根皮质（41.9）、营养期肉质根肉质（41.4）、花期花（9.7）、营养期叶（1.0）、花期荚果（0.6）、花期肉质根肉质（0.2）。RsCHS1基因在不同组织部位都有表达，并具有组织表达特异性，在萝卜肉质根的肉质和皮质以及花中的相对表达量比叶和荚果中高，并在肉质根肉和皮中显著表达。

图6 RsCHS1在胭脂萝卜不同组织部位的表达情况Fig.6 Expression analysis of RsCHS1 gene in different tissues of red radish

2.7 转基因阳性植株筛选与鉴定

利用农杆菌介导法侵染拟南芥植株，经过Kana抗性筛选，获得了RsCHS1转基因植株（图7）。将筛选的RsCHS1-a转基因拟南芥植株和RsCHS1-b转基因拟南芥植株进行PCR 检测，同时以未转化拟南芥（WT）植株叶片总DNA 为模板作阴性对照，电泳检测结果分别如图8 所示，结果表明，已经成功将RsCHS1基因转入拟南芥基因组中。成活的抗性植株具有明显性状，叶柄处及茎有红色素沉淀，颜色由绿变红（图9）。

图7 经抗性筛选获得的RsCHS1转基因拟南芥植株T1代苗Fig.7 T1 generation seedlings of RsCHS1 transgenic Arabidopsis thaliana plants obtained by resistance selection

图8 转基因阳性植株T3代阳性苗PCR检测结果Fig.8 PCR results of T3 generation positive seedlings of transgenic positive plants

图9 转基因T3代阳性植株和野生型植株Fig.9 Transgenic positive plants of T3 generations and wild type plants

3 结论与讨论

3.1 胭脂萝卜CHS1基因编码蛋白质的理化性质及特点

CHS基因在高等植物中分布广泛，其氨基酸同源序列表现出较高同源性，CHS1 蛋白总体结构较为保守[30]。本试验克隆得到2 个萝卜RsCHS1基因，将2 个CHS 蛋白序列和青菜、芜青和甘蓝等6 个十字花科以及烟草和葡萄2个植物的编码蛋白进行同源性分析和进化树构建，结果表明，RsCHS1 蛋白和十字花科植物CHS 蛋白同源性较高，具有较近的进化关系。这和李彩虹等[5]、许明等[4]、徐靖等[12]的研究结果相同，认为十字花科植物RsCHS1基因相对保守，因此推测萝卜RsCHS1 蛋白与十字花科其他植物CHS 蛋白可能具有相似的生物学功能，可以通过研究RsCHS1基因在模式植物拟南芥色素积累中的作用机制，推测RsCHS基因参与萝卜色素积累的分子机制。本研究克隆了2个萝卜RsCHS1基因，分别编码254、321 个氨基酸，这与甘草GuCHS14（284个）和GuCHS12（336 个）的数目相近[31]，但是与红花檵木LcCHSs（分别为389、393 个氨基酸）[5]、马铃 薯StCHS4和StCHS5（389 个 氨 基 酸）[32]、葡 萄VvCHS（389个氨基酸）[33]有一定的区别，可能是因为在不同的植物中CHS的功能有冗余。

3.2 胭脂萝卜CHS1基因表达模式

揭示萝卜CHS基因在萝卜中不同部位的表达量，有助于分析RsCHS基因在萝卜色素积累中的分子机制。本试验结果表明，RsCHS1基因在营养期肉质根皮质、营养期肉质根肉质、花期花、营养期叶、花期荚果、花期肉质根肉质等不同器官和组织中都有表达，这和许明等[4]对藤茶CHS1的研究结果一致。RsCHS1基因在萝卜肉质根的肉质和皮质以及花中的相对表达量比叶和荚果中高，说明了CHS1基因具有组织表达特异性，这与在水稻[22]、白木香[15]、藤茶[4]、彩色棉[13]、红花[9]和灰毡毛忍冬[6]CHS1基因研究中的结果一致。胭脂萝卜的肉质根皮及肉质含有丰富的花青素，在营养期肉质皮中RsCHS1表达量最高，肉质根表达量第二，CHS1基因的表达量与花青素含量密切相关，说明CHS1在花青素的积累中有着重要的作用，这与陈发波等[27]、徐靖等[12]的研究结果一致。但是与许薇等[34]关于三华李研究有一定的区别，三华李CHS基因在果肉中表达量最高，皮质中表达量最低，而在胭脂萝卜中营养期的皮质表达量最高，肉质根次之，两者间表达量有一定差异，这可能和胭脂萝卜的品种特殊性有关。发育后期RsCHS1表达量相差不大，这可能说明了RsCHS1可能并不是花青素积累的关键基因。本试验还发现，RsCHS1-a与RsCHS1-b两个查尔酮合成酶基因在同一时期同一组织部位的表达量有差异，推测萝卜色素的积累可能与基因型有关，陈发波等[27]的研究也表明萝卜肉质根中色素的积累还与萝卜品种相关，这为高色素萝卜品种选育提供了重要理论依据。

3.3 胭脂萝卜CHS1基因功能分析

大量的研究表明，查尔酮合成酶基因CHS能够调控植物花青素的合成[3，8-9，11-12，25]。肖伟等[3]在百合花的研究中发现，CHS能够调控百合花的花色；刘玥等[8]在大花君子兰的研究中证明了CmCHS在开花阶段以及着色组织中变量表达，证明CmCHS具有重要的作用；陈发波等[27]通过研究胭脂萝卜不同肉质根色素含量和CHS基因的相关性证明了CHS的调控作用。胭脂萝卜中富含的萝卜红色素，是一个天然的着色剂，被广泛应用于食品、化妆品等领域。但是目前关于胭脂萝卜大量积累花青素分子机制并不清楚，相关的研究也较少。因此，研究胭脂萝卜RsCHS1基因功能，有助于解析胭脂萝卜红色素的积累机制。本研究利用农杆菌介导法转化拟南芥植株，发现阳性植株和野生型拟南芥植株表型差异明显，转基因植株叶柄和茎有红色素累积，据此推测，RsCHS1在胭脂萝卜红色素积累中起到了关键作用，可以通过基因工程过表达RsCHS1基因，从而提高胭脂萝卜红色素的产量。下一步研究可以将RsCHS1基因转入萝卜中，验证RsCHS1基因是否可以增加萝卜花青素的含量。

综上，本研究克隆了萝卜花青素合成相关基因RsCHS1，对其蛋白质序列进行了同源性分析及进化分析，并分析了其表达模式。结果表明，RSCHS1基因与十字花科植物CHS序列同源性较高，为97%～99%，说明RsCHS1基因在十字花科植物中相对保守，RsCHS1基因可能与十字花科其他物种CHS基因具有相似的生物学功能。qRT-PCR 结果表明，萝卜RsCHS1基因在胭脂萝卜不同组织部位都有表达，具有组织表达特异性，在肉质根肉质和皮中显著表达。转RsCHS1基因拟南芥植株的叶柄和茎上有红色素沉积，推测RsCHS1在胭脂萝卜红色素积累中起到关键作用。本研究结果为解析胭脂萝卜大量积累色素的分子机制奠定了基础。