48 份黑果枸杞种质主要表型和品质性状的遗传多样性研究

王晓洁，黎美霞，陶 蕾，张 波，何昕孺，米 佳，戴国礼，徐文娣

（1.宁夏农林科学院 枸杞科学研究所/国家枸杞工程技术研究中心，宁夏 银川 740002；2.北方民族大学 生物科学与工程学院，宁夏 银川 750021；3.北方民族大学 经济林遗传改良创新团队，宁夏 银川 750021）

黑 果 枸 杞（Lycium ruthenicumMurr.）是 茄 科（Solancea）枸杞属（Lycium）灌木植物，是我国西北荒漠地区一种耐旱耐盐碱抗风沙植物，对西北地区防风固沙、土壤改良及生态环境保护具有重要意义[1]。成熟果实多为紫黑色或白色浆果，富含维生素、糖类和有机酸，可作为保健食品的原料[2]。黑果枸杞所含的多糖具有防治糖尿病[3]和抗疲劳[4]作用；所含的黄酮具有抗氧化活性和降血脂作用[5]；富含的大量花色苷类物质具有体外抗氧化作用[6]，其花色苷含量及体外抗氧化活性均显著优于蓝莓、树莓，也显著高于红果枸杞[7]。随着人们生活水平的提高，枸杞市场需求量也逐年增长，近几年红果枸杞栽培种已在各地实现了大面积种植，但黑果枸杞具有棘刺多、难采摘和耗时长等缺点，在各地仍处于野生状态，而且在部分地区每年仅有1 次果实成熟采摘期，导致以黑果枸杞为原料的加工产品价格极其昂贵。

植物遗传多样性是植物表型学、细胞学、生理生化及分子生物学等领域涵盖的种群间及个体间遗传变异的总和，其中植物叶片、果实大小等表型性状受生态环境条件影响明显，具有丰富的遗传变异，已经成为遗传育种工作的研究热点。目前，国内利用分子标记技术分析黑果枸杞遗传多样性的研 究 较 多。 王 锦 楠 等[8]利 用AFLP（Amplified fragment length polymorphism）对柴达木地区的5 个黑果枸杞种群遗传多样性进行了分析；有学者利用ISSR（Inter-simple sequence repeat）技术对新疆南部等的8 个黑果枸杞自然居群进行了遗传多样性分析[9]；黄兴发等[10]在对无性系的黑果枸杞基因组测序基础上建立了黑果枸杞SSR（Simple sequence repeat）标记检索数据库，为研究黑果枸杞遗传多样性提供SSR 标记支撑。目前，国内外学者利用表型性状对较多植物种群进行了遗传多样性分析，伴随表型数据采集技术的提高，其在阐明种群变异结构、来源和规律方面的作用日益凸显，为植物资源收集、保护或遗传改良提供了重要研究基础[11-12]。

黑果枸杞是我国西北地区重要的天然药用植物资源，但关于其表型和品质性状的遗传多样性研究相对较少。鉴于此，拟利用描述性统计、主成分、相关性和聚类分析这4 种方法，对48 份黑果枸杞种质资源的18种表型和品质性状进行测定，并分析黑果枸杞种质主要性状的遗传多样性，为鉴别特异种质、确定核心亲本、提高黑果枸杞的产量与品质，以及野生黑果枸杞人工驯化与遗传改良提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料及试验地概况

48 份黑果枸杞种质资源定植于国家枸杞种质资源圃，该资源圃位于宁夏回族自治区银川市西夏区芦花台试验地（东经106°09′、北纬38°39′）。该地为中温带干旱大陆性气候，干旱少雨、日照充足，年平均气温8.5 ℃，年平均日照时数2 800～3 000 h，年平均降水量200 mm。试验地土壤以淡灰钙土为主，pH 值为8.2～8.7[13]。48 份黑果枸杞种质采用篱架栽培，定植株行距为0.5 m×3.0 m，定植年份、来源等信息详见表1。

表1 48份黑果枸杞种质的基本信息Tab.1 Basic information of 48 L.ruthenicum Murr.germplasm resources

1.2 试验化学试剂和仪器

试验化学试剂主要有氯化钾（成都市科隆化学品有限公司）、36%盐酸（天津市大茂化学试剂厂）、醋酸钠（天津市凯通化学试剂有限公司）、冰乙酸（MREDA 公司）、甲醇（MREDA 公司）、三氟乙酸（MREDA 公司）。试验仪器主要有电子游标卡尺（MC 量制浙字01010235）、Scan Maker i600 扫描仪（上海中晶科技有限公司）、紫外可见分光光度计TU1810（北京普析通用仪器有限责任公司）、电子分析天平AUY200（德国赛多利斯公司）、SHZ-Ⅲ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）、全数字超声波发生器（武汉嘉鹏电子有限公司）。

1.3 测定指标和方法

黑果枸杞表型数据测定参照参考文献[14]进行，为降低树龄对表型差异的影响，本研究均以1年生结果枝为对象，进行表型数据采集。各项指标测定及果实采摘时间集中于2022年8月上旬。

1.3.1 黑果枸杞枝长和枝粗的测定 对每份种质1年生单株结果主枝条数和单株结果侧枝条数进行记录；每份种质随机选取冠面中上部5根侧枝，用卷尺从枝条基部测量至顶端即为枝长，用标准游标卡尺测量该枝条基部即为枝粗。

用于指标测量的叶片应具有完整叶形且无明显病虫害。从采摘回来的3 段枝条中各选出1 个无棘刺芽眼的叶簇，用扫描仪检测该芽眼所有叶片的叶长、叶宽和叶面积，并记录叶片形状和单簇叶片数，重复3次。

叶片形状及判断标准，条形：近无柄；条状披针形：近披针形，叶片基部宽度较大；倒披针形：呈狭披针形，叶尖顶端钝圆。

1.3.3 黑果枸杞果实的果形指数等指标的测定

使用枝剪剪下每份种质各5 根超过20 cm 的枝条，标记装袋放在保温箱4 ℃储存，在采摘后6 h 内测量并记录果柄长、果实横径、果实纵径、平均单果质量、单枝成熟果实数、单枝未成熟果实数、果实颜色和果实形状，之后立即使用锡箔纸包裹鲜果于-20 ℃避光冷冻保存，用于品质性状即果实内花色苷含量的测定。

用于指标测量的果实要求成熟且无病虫害和机械损伤。将采摘的枝条进行统一修剪，留下含顶端的20 cm 枝条，记录其单枝成熟果实数、单枝未成熟果实数和果实颜色；从枝条上修剪下5 个完整的果柄，用扫描仪分析测定果柄长；随机选取30 个完整的鲜果，先对果实形状进行判定，再用扫描仪分析测定果实横径和果实纵径，然后对这5 根枝条上的所有成熟且完整的果实进行计数和称质量，计算平均单果质量。

果实形状的判断标准：球状（近球形），果形指数在1.00～1.20；扁球状（球形呈压扁状），果形指数＞1.20；桃状（似桃形），果形指数＜1.00[15]。

果实颜色及判断标准：黑色、玫红色（果实顶部颜色多为玫红色、紫色，下半部白色）、白色、无色（果实基部为白色，顶部近无色）[15]。

2015年，李克强总理在政府工作报告中首次提出制定“互联网+”行动计划，“互联网+”一跃成为社会各界追捧的热词。2015年7月，国务院印发《关于积极推进“互联网＋”行动的指导意见》，其中对“互联网+”的解释是“把互联网的创新成果与经济社会各领域深度融合，推动技术进步、效率提升和组织变革，提升实体经济创新力和生产力，形成更广泛的以互联网为基础设施和创新要素的经济社会发展新形态”。

1.3.4 黑果枸杞果实花色苷的提取和含量测定

HCl-KCl 溶液的配制：准确称取7.45 g 氯化钾定容至500 mL 后装瓶备用；取8.5 mL 浓盐酸定容至500 mL 后装瓶备用，将其以体积比25∶67 配制成盐酸-氯化钾溶液，使用pH 计调pH 值为1±0.1。醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制：准确称取18 g 醋酸钠溶于水中，取醋酸4.9 mL 倒入醋酸钠溶液中，用水定容至1 000 mL，用醋酸调pH 值为4.5±0.1，装瓶贴好标签放置冰箱备用。

称取黑果枸杞鲜果样品约12.0 g，加入液氮进行研磨（不宜在光照环境放置太久），准确称取研磨样品10.0 g，置于50 mL 离心管（用锡箔纸包裹作避光处理），加入30 mL 0.5%三氟乙酸-甲醇溶液，避光超声辅助提取15 min（超声频率40 kHz），随后抽滤、收集滤液，将滤渣继续提取2次，合并滤液，浓缩至10 mL，即得提取液[16]。各取1 mL 提取液于2支10 mL 的试管中，分别加入9 mL 的HCl-KCl 溶液和9 mL 的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，即提取液分别用pH值1.0和4.5的缓冲液稀释10倍，混合均匀后作试验组；采用0.5%的三氟乙酸-甲醇溶液作空白对照组。分别测定每种样品在pH 值1.0 和4.5 时530、700 nm 处的吸光度，然后按照参照文献[17]中的方法计算总花色苷含量（以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷计）。

1.3.5 黑果枸杞性状指标赋值 基于参考文献[15]、[18]，结合实际情况选取了黑果枸杞的18 种主要表型、品质性状指标并赋值，如表2 所示。包括15 个数量性状（枝长、枝粗、叶长、叶宽、叶面积、单簇叶片数、果柄长、果实横径、果实纵径、平均单果质量、单枝成熟果实数、单枝未成熟果实数、单株结果主枝条数、单株结果侧枝条数和花色苷含量）和3个质量性状（叶片形状、果实形状和果实颜色）。

表2 黑果枸杞性状类型指标及赋值Tab.2 Traits and taxonomic evaluations of L.ruthenicum Murr.

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2019 整理数据，获取各指标最大值（Max）、最小值（Min）、平均值（Mean）、标准差（SD）、变异系数（CV）以及遗传多样性指数（H’）[19]。使用SPSS 23.0进行主成分分析，为便于比较，首先对数值进行标准化转换，然后对标准化后的数据进行主成分分析，对数值进行KMO和巴特利特球形度检验，取KMO 取样适切性量数≥0.6、提取特征值＞1.0 的主成分。使用Origin 2019 进行相关性及聚类热图分析，其中采取皮尔逊（Pearson）相关系数分析方法对标准化数据进行相关性分析；采用离差平方和法（Ward 法），并以欧氏距离（Euclidean distance）为种质间遗传距离进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 48份黑果枸杞种质的数量性状分析

如表3 所示，48 份黑果枸杞种质的数量性状变异系数在19%～189%，其H’在1.431～2.095，表明48份黑果枸杞种质资源拥有丰富的遗传多样性。单株结果主枝条数、单株结果侧枝条数、单枝成熟果实数、单枝未成熟果实数、单簇叶片数和平均单果质量为黑果枸杞产量的数量性状指标。其中，单枝成熟果枝数的H’最高，为1.987，变异系数为57%；单枝未成熟果实数的H’为1.431，变异系数最高，为189%。果实横径、果实纵径、果柄长和花色苷含量为黑果枸杞果实的数量性状指标，果实纵径的H’为2.095，变异系数为19%；果实横径的H’为2.093，变异系数为19%；果柄长的H’为1.763，变异系数为25%；花色苷含量的H’为1.807，变异系数为74%。叶长、叶宽和叶面积为黑果枸杞叶片的数量性状指标。其中，叶宽的H’最高（1.983），其变异系数为34%；叶面积的H’最低（1.607），其变异系数为77%。枝长和枝粗为黑果枸杞枝条的数量性状指标，枝长的H’为2.003，变异系数为29%；枝粗的H’为2.014，变异系数为24%。

2.2 48份黑果枸杞种质的质量性状分析

黑果枸杞叶片形状分为倒披针形、条状披针形和条形3 种，如图1 所示；果实颜色分为白色、玫红色和黑色3 种，如图2 所示；果实形状分为球状、扁球状和桃状3 种，如图3 所示。48 份黑果枸杞种质资源叶片性状调查结果表明，叶形为倒披针形的最多，占50.0%；其次为条形，占39.7%；条状披针形的占10.3%。果实形状以扁球状为主（43.7%），其次为球状（41.7%）和桃状（14.6%）。果实颜色中以黑色占主导地位（68.7%），其次为白色（4.2%）和玫红色（27.1%）。3 个质量性状的H’在0.745～1.007，其中果实形状的多样性指数最高，达1.007；叶片形状的多样性指数为0.948；果实颜色的多样性指数为0.745（表4）。

图1 48份黑果枸杞种质叶片形状Fig.1 Leaf shapes of 48 L.ruthenicum Murr.germplasm resources

图2 48份黑果枸杞种质果实颜色Fig.2 Fruit colors of 48 L.ruthenicum Murr.germplasm resources

图3 48份黑果枸杞种质果实形状Fig.3 Fruit shapes on germplasm resources of 48 L.ruthenicum Murr.

表4 48份黑果枸杞种质3个质量性状的遗传多样性分析Tab.4 Assessment on genetic diversity of 3 qualitative traits of 48 L.ruthenicum Murr.germplasm resources

2.3 48份黑果枸杞种质主要表型和品质性状的主成分分析

利用主成分分析将多个性状指标转化为较少的几个主成分，从而可以探究导致种质遗传多样性的主要影响因子，其中特征值和贡献率是选择主成分的依据，参照参考文献[20]以特征值＞1.0 为标准提取主成分。本研究中，基于48份黑果枸杞种质的18 种主要表型和品质性状的主成分分析的KMO 取样适切性量数=0.647，该值＞0.6。由表5 可知，特征值＞1.0 的主成分共计6 个，累计贡献率达到80.09%，表明这6 个主成分包含了黑果枸杞绝大部分的变异信息，可以反映18种主要表型和品质性状的基本特征。

表5 48份黑果枸杞种质的18种主要表型和品质性状的主成分分析Tab.5 Principal component analysis of 18 main phenotypic and quality traits of 48 L.ruthenicum Murr.germplasm resources

从表5 的结果可以看出，6 个主成分涵盖了黑果枸杞种质的绝大部分变异性状，累计贡献率为80.09%。第1主成分特征值最大，为6.30，贡献率为34.99%，果实纵径对主成分1影响最大，其次是果实颜色、叶面积、花色苷含量。第2 主成分贡献率为14.00%，果实横径和叶长对主成分2 影响较大。第3 主成分贡献率为8.95%，枝粗对主成分3 影响最大。第4、5、6 主成分贡献率分别为8.31%、7.38%、6.47%，单株结果主枝条数、单枝未成熟果实数和单枝成熟果实数分别对主成分4、5、6的影响较大。综合考量18个性状与黑果枸杞产量及品质的关系，筛选果实纵径、果实颜色、叶面积、花色苷含量、果实横径和枝粗6个性状作为反映黑果枸杞产量及品质的主要指标。

2.4 48份黑果枸杞种质主要表型和品质性状的相关性分析

如图4 所示，黑果枸杞种质资源的18 种主要表型和品质性状指标间相关程度较高，各性状间相互影响较大。其中，叶长、叶宽、叶面积和果柄长间呈极显著正相关关系（P＜0.01）；果柄长与单枝未成熟果实数呈极显著正相关关系（P＜0.01）；果实横径、果实纵径和单株结果侧枝条数间呈极显著正相关关系（P＜0.01）；果实横径、平均单果质量和枝粗间呈极显著正相关关系（P＜0.01）；果实横径、平均单果质量、单簇叶片数间呈极显著正相关关系（P＜0.01）；单株结果主枝条数与单株结果侧枝条数呈极显著正相关关系（P＜0.01）；花色苷含量、果实颜色和单枝成熟果实数间呈极显著正相关关系（P＜0.01）；果柄长与果实形状、果实颜色、花色苷含量和枝粗均呈极显著负相关关系（P＜0.01）。

图4 48份黑果枸杞种质的18种主要表型和品质性状的相关性分析Fig.4 Correlation analysis of 18 main phenotypic and quality traits of 48 L.ruthenicum Murr.germplasm resources

2.5 48份黑果枸杞种质主要表型和品质性状的聚类分析

基于主要表型和品质性状的聚类分析能够初步反映各类群的相似性和亲缘关系，遗传相似性越高，种质资源的数量越密集[21]。根据6 个主成分特征向量绝对值大小从18 个指标中筛选出16 个指标（叶长、叶宽、叶面积、果柄长、单枝未成熟果实数、果实纵径、果实横径、平均单果质量、单株结果主枝条数、单株结果侧枝条数、枝粗、花色苷含量、单枝成熟果实数、单簇叶片数、果实形状和果实颜色）进行聚类，结果如图5 所示，在欧氏距离10.0 处将48份枸杞种质聚为六大类群。

图5 48份黑果枸杞种质基于16种主要表型和品质性状的聚类分析Fig.5 Clustering analysis of 48 L.ruthenicum Murr.germplasm resources based on16 main phenotypic and quality traits

第Ⅰ类群包含6 份种质，其中4 份来源于甘肃，2份来源于新疆。其主要特征是果实形状为桃状和扁球状，颜色为玫红色，枝条较细，叶片大且宽，果实较小且质量较低，产量适中，花色苷含量在6个种群中处于第5 位。第Ⅱ类群包含3 份种质，均来源于青海。其主要特征是果实形状为扁球状，颜色为白色和玫红色，枝条细，叶片细小，果实小且质量低，产量较高，花色苷含量在6 个种群中处于第6位。第Ⅲ类群包含6 份种质，其中4 份来源于新疆，1份来源于甘肃，1份来源于青海。其主要特征是果实形状为桃状和扁球状，颜色为玫红色，枝条细，叶片大小中等，果实大小和质量适中，产量最低，花色苷含量在6个种群中处于第4位。第Ⅳ类群包含19份种质，其中13 份来源于青海，4 份来源于新疆，2份来源于甘肃。其主要特征是果实形状为扁球状和球状，颜色均为黑色，其枝条粗，叶片较小，果实大小中等但质量最高，产量适中，花色苷含量在6个种群中处于第3位。第Ⅴ类群包含4份种质，其中2份来源于甘肃，1 份来源于青海，1 份来源于新疆。其主要特征是果实形状为扁球状和球状，颜色均为黑色，其枝条较粗，叶片较大，果实较大且质量较高，单枝产量最高，花色苷含量在6个种群中处于第1 位。第Ⅵ类群包含10 份种质，其中6 份来源于青海，4 份来源于新疆。其主要特征是果实形状为扁球状和球状，颜色均为黑色，其枝条粗，叶片小，但果实较大且质量较高，其产量适中，花色苷含量在6个种群中处于第2位。

指标层聚为两大类，第一类包括叶长、叶宽、叶面积、果柄长、单枝未成熟果实数；第二类包括果实纵径、果实横径、平均单果质量、单株结果主枝条数、单株结果侧枝条数、枝粗、果实颜色、花色苷含量、单枝成熟果实数、果实形状和单簇叶片数。聚类结果与相关性分析结果一致。

3 结论与讨论

本研究中，人工收集保存的48份黑果枸杞野生种质具有丰富的遗传多样性，18种表型包含了15个数量性状和3 个质量性状（叶片形状、果实形状、果实颜色），数量和质量性状指标的变异系数反映性状的离散程度，且与离散程度呈正相关，变异系数越大，说明获得优良性状的可能性就越大[22-27]。数量和质量性状的H’高，说明这些性状具有较为丰富的变异信息，是研究种质资源多样性的另一重要指标[28]。卢文晋等[29]的研究表明，人工栽培条件下黑果枸杞存在果实性状、枝条和叶片形态等方面的变异。本研究中，黑果枸杞的不同性状在不同种质之间表现出了不同程度的变异性和多样性。其中，单枝未成熟果实数变异系数最大（189%），这可能与采摘时间和果实成熟时间有关，说明种质包含分批成熟型和集中成熟型果实。

主成分分析结果表明，六大主成分累计贡献率达80.09%。当性状在某个主成分中的特征向量绝对值＞0.5 时，认为将其可代表该主成分主要反映的信息[30]。六大主成分反映的各指标信息方面，第1主成分：果实纵径、果实颜色、叶面积、花色苷含量、叶长、叶宽、平均单果质量、果柄长、枝粗、果实横径、单株结果侧枝条数、果实形状；第2主成分：果实横径、叶长、平均单果质量、叶面积、叶宽；第3 主成分：枝粗；第4主成分：单株结果主枝条数、单株结果侧枝条数；第5 主成分：单枝未成熟果实数；第6主成分：单枝成熟果实数、单簇叶片数。在六大主成分中按信息载量选择1～2 个主要特征向量，最终筛选出果实纵径、果实颜色、叶面积、花色苷含量、果实横径、枝粗6个主要特征向量，作为黑果枸杞新品种选育亲本评价的重要指标。

相关性分析和聚类分析结果表明，果实横径、平均单果质量和枝粗间呈极显著正相关关系（P＜0.01），且果实横径、平均单果质量、单簇叶片数间呈极显著正相关关系（P＜0.01），表明在黑果枸杞人工选育中，1年生枝条枝粗和单簇叶片数量可作为种质筛选的重要指标。刘桂英等[31]对柴达木盆地的野生黑果枸杞区域3 个野生群体的19 种表型性状进行比较分析发现，野生黑果枸杞表型性状的果实性状（果柄长、果实横纵径、果形指数、最大单果质量和百果质量）在群体间存在显著性差异，其他的表型性状（当年生和木质化枝条的枝长、叶簇数、叶长、叶宽、叶形指数和老叶的叶长、叶宽、叶形指数）在群体间不存在显著性差异，以上研究结果与本研究具有一致性。黑果枸杞花色苷含量和单枝成熟果实数呈极显著正相关关系（P＜0.01），表明果实采摘时间和花色苷含量存在密切联系。聚类研究结果表明，在欧式距离为10.0 处，将其分为六大类，每一类群都有不同特征，对于进一步进行黑果枸杞品种人工定向选育具有重要参考意义。

目前，利用分子标记技术对黑果枸杞遗传多样性的研究，从分子层面解析黑果枸杞遗传变异和群体结构[8-10]，对黑果枸杞核心种质挖掘和种质的筛选具有重要意义，但存在一定局限性，其结果需要通过与表型数据进行关联分析，才能确定标记与表型的连锁关系，从而指导新品种的选育。本研究从表型性状出发，建立黑果枸杞表型指标数据测定及评价方法，筛选出的主要表型指标和核心种质，可为下一步开展黑果枸杞分子标记与表型性状间相关分析提供参考。