荧光标记技术在新型农用化合物创制中的应用现状及进展

文 鼎，张 亚，刘双清，王 翀，廖晓兰

（1.湖南农业大学 植物保护学院，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学 生物科技学院，湖南 长沙 410128）

农药是农业生产中必不可少的战略物资，在预防、控制或消除病虫草害以及植物生长调节方面都有不可或缺的作用，但是不合理使用农药导致农药过量残留和目标生物抗药性，而高毒或高残留农药的长期使用危害人体健康及其生存环境，严重威胁着人类生命安全和生态环境安全[1]。新型农用化合物的创制过程漫长，从最初的化合物筛选到最后剂型设计与大田检验都要耗费大量的时间与资金。即时确定化合物对目标生物的作用机制，观察化合物在目标生物中的传递与积累等情况可以大大加快新型农用化合物的创制速度。荧光标记技术是将荧光染料标记在目标物质上的技术，是一种高效、便捷的辅助技术，可以快速对目标物质进行观察与分析，广泛应用于食品、医学、兽医等领域，在有害物质检测、肿瘤及病症诊断和药物开发方面有着重要贡献，可分为荧光探针技术与免疫荧光技术等。近年来，在农用化合物的创制中，荧光标记技术受到了特别的青睐，常应用于筛选特定靶点的新型农用化合物、相关靶点验证、目标生物活体成像等方面[2-3]。然而，现有文献主要聚焦于量子点、近红外荧光探针、免疫荧光层析法等单一技术报道，缺乏对近10 a 荧光染料、荧光探针技术与免疫荧光技术在农用化合物创制领域的综合性报道。基于此，综述了荧光标记技术在农用化合物创制领域应用的新进展，以期为农用化合物创制提供新思路与理论依据。

1 荧光染料分类及特殊荧光染料在农用化合物创制中的应用

不同种类的荧光染料是荧光标记技术的基础。荧光染料种类众多，不同荧光染料有其独特的光物理化学性质，并且随着荧光标记技术的推广与发展，越来越多有着特殊作用或特殊功能的荧光染料被发现与改进。荧光染料通常分为常见荧光染料与特殊荧光染料。常见荧光染料代表的是技术成熟、物理化学性质及修饰改造方向已经基本明确的染料，此类染料大都有着成熟的产品面市，具有相对固定的优势与缺陷；而特殊荧光染料是指结构相似或某种性质相似的一类染料，与常见荧光染料相比具有某些突出的优点，但相关研究及修饰改造方向尚未被完全开发，仍然存在着许多的问题，同时也有着许多的可能性。新型农用化合物创制中需要设计出有特定荧光特性的荧光染料，对荧光染料进行修饰与改造是必不可少的。不同的修饰与改造会使荧光染料的激发和发射波长、荧光稳定性、荧光强度等荧光特性发生改变，从而制作出符合试验设计的荧光染料，如卤代荧光素中卤素原子越大或越多都会造成卤代荧光素发射波长越大，氯原子取代则会造成卤代荧光素的荧光寿命和量子产率增大[4]。

1.1 常见荧光染料

常见的荧光染料通常按照化合物结构性质进行分类（表1），可以分为荧光素类、罗丹明类和芘类等，都有较为成熟的技术及产品。常见的荧光染料都有着不同的优点与不足，经过对荧光染料的修饰与改造后可以增加该种荧光染料的优点或弥补其不足，如荧光素类荧光染料具有光稳定性高、量子产率高、灵敏度高等优点[5]，但其具有细胞毒性与细胞膜通透性差等不足[5-6]，对荧光素修饰与改造后形成的异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）解决了细胞毒性与细胞膜通透性差的问题，在新型农用化合物创制中常用于细胞成像和农用化合物抗体结合检测等方面。

表1 不同类别的常见荧光染料Tab.1 Classification of common fluorescent dyes

1.2 特殊荧光染料在农用化合物创制中的应用

特殊荧光染料的开发研究通常晚于常见荧光染料，同时其具有更独特的优势和相应的缺陷。特殊荧光染料在农用化合物创制方面的研究虽然不如常见荧光染料，但特殊荧光染料研究热点中的石墨烯量子点、稀土材料及纳米粒子等凭借着突出的优点在农用化合物创制中有着不可小觑的应用潜力。

1.2.1 石墨烯量子点 量子点（Quantum dots，QDs）一般是由Ⅳ、Ⅱ-Ⅵ、Ⅳ-Ⅵ或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的准零维类球形半导体纳米材料。常见的量子点有碳量子点（Carbon quantum dots，CDs）、碲化镉（CdTe）量子点和石墨烯量子点（Graphene quantum dots，GQDs）等。量子点通过不同条件的合成与修饰方法可使其在紫外到近红外范围内都有吸收峰，并且优异的荧光稳定性和抗光漂白特性提高了荧光标记的准确性，但在活体生物体内聚集进行标记仍然有一定的细胞毒性[23]。量子点中石墨烯量子点具有优异的化学稳定性、高量子产率和良好的生物相容性等特点，是现今量子点开发的热点[24]。出色的荧光特性使量子点在成像和传感器方面应用广泛，而在新型农用化合物创制方面，量子点主要应用于靶点检测上。乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是农用化合物重要的作用靶点，化合物有效成分能与乙酰胆碱酯酶结合使目标生物体内乙酰胆碱不断积累从而杀死目标生物。HE 等[25]使用蛋白质交联剂将石墨烯量子点固定在乙酰胆碱酯酶上，运用低浓度Hg2+猝灭石墨烯量子点荧光以及硫代胆碱与Hg2+作用恢复荧光石墨烯量子点荧光的原理，开发了一种高灵敏度的乙酰胆碱酯酶石墨烯量子点荧光传感器，试验使用2种传统乙酰胆碱酯酶抑制剂对氧磷（Paraoxon）和他克林（Tacrine）来验证石墨烯量子点荧光传感器的灵敏度和检测限，结果显示，对氧磷和他克林的半抑制浓度（IC50）分别为63.76 nmol/L和14.07 nmol/L，低于其他荧光标记文献报道的数据（5.25 μmol/L 和67.5 nmol/L）[26]，后续可通过此石墨烯量子点荧光传感器更好地筛选并设计作用于乙酰胆碱酯酶的新型农用化合物。量子点荧光传感器为筛选作用于特定靶点的新型农用化合物提供了方法和理论支撑，减少了新型农用化合物的开发时间与成本。另外，石墨烯量子点还具有低细胞毒性这一特点，使得量子点也可以朝活体荧光染料方向发展，其与传统的半导体量子点相比，具有更大的比表面积和直径，可以容纳更多的

活性基团，在医学领域已实现了体外细胞成像和体内初步成像，但在农用化合物创制领域鲜有报道，这与石墨烯量子点制备耗时多、难度大以及在红外成像波段石墨烯量子产率不高有关[27-28]，能否解决上述问题，是石墨烯量子点在农用化合物创制方面发展的关键。

1.2.2 绿色荧光蛋白 绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是由238 个氨基酸残基组成的自发荧光蛋白，荧光稳定好，相比于荧光素类物质，GFP 抗光漂白能力和灵敏度更强。将GFP 片段连接在目标生物体片段中，其产生荧光是生物细胞的自主功能，不需要任何外源反应底物，这一特性使得GFP 具有低细胞毒性特点，可以进行活体生物示踪和成像等检测，更适用于定量测定与分析，如王淼等[29]将GFP 与生防菌株变形斑沙雷氏菌（Serratia proteamaculans）336x 基因片段连接，在小麦组织中根据GFP 产生的绿色荧光跟踪观察336x的定殖与分布，为研究生防菌株336x的作用机制提供了依据。GFP 相关衍生物还有增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）、增强型黄色荧光蛋白（Enhanced yellow fluorescent protein，EYFP）和增强型蓝色荧光蛋白（Enhanced blue fluorescent protein，EBFP）等，都是由GFP 氨基酸突变而来。在新型农用化合物创制中，GFP 常用来指示目标生物基因片段或蛋白质，也用来测定目标生物基因调控差异等方面。SHEN 等[30]将朱砂叶螨（Tetranychus cinnabarinus）体内蜕皮激素受体（Ecdysone receptor，EcR）进 行RNA 干 扰（RNA interference，RNAi）并用GFP 标记，结果发现，蜕皮激素受体表达被沉默时，73.1%的朱砂叶螨未能存活到幼虫期，成虫率仅为11.7%，而对照组各阶段存活成功率为86.7%，说明螨类蜕皮激素受体是良好的杀虫剂靶点，为后续研制相关靶点抑制剂提供了试验基础。GFP 是良好的体内蛋白质荧光标记物，对于筛选与探究新型农用化合物的作用位点及作用方式等方面具有重要作用。

1.2.3 长余辉纳米粒子 长余辉纳米粒子（Persistent luminescence nanoparticle，PLNP）是一种在被激发后能持续发光的特殊纳米材料。PLNP 具有激发后自持续发射、穿透深度强、高信噪比与可重复激发等特有光物理化学性质。ZHAO 等[31]与XUE 等[32]分别制作了可用于检测癌细胞的PLNP 探针和可重复激发PLNP 探针，证明PLNP 探针在生化分析检测、癌细胞追踪、肿瘤靶向成像与诊疗一体化等方面有着广泛的应用前景[27]。在新型农用化合物创制方面，PLNP 并未在国内得到有效应用，但ZHANG 等[33]通过PLNP（La3Ga5GeO14：Cr3+、Zn2+）制作了能够特异性结合并示踪敌百虫的纳米载体LGGO@MIP，展示了敌百虫在小鼠血液和肠胃中的运动过程和在肝脏中的积累过程。未来新型农用化合物创制阶段后期也可以通过此项技术结合农用化合物进行非靶标生物的毒性代谢与检测试验。但PLNP 材料仍然存在成本过高、不易修饰和灵敏度不足的缺点[34]，这也是未来PLNP 材料需要攻克的难题。

1.2.4 稀土纳米材料 稀土发光纳米材料（Rareearth nanoparticles，RENPs）是利用稀土特殊性质研发的一类优质光学材料，具有寿命长和荧光稳定性高等特点。RENPs 在生物传感器、细胞成像和活体成像中都有应用，在农用化合物检测中也有较好的应用。硝基还原酶广泛存在于细菌中，可以降解具有农用作用的硝基芳香化合物如硝磺草酮等[35-36]。BRENNECKE 等[37]发明了一种检测细菌中硝基还原酶的RENPs 复合探针，运用此探针在与硝基还原酶作用时发光的原理检测硝基还原酶的质量浓度，虽然探针检出限仅为4.4 ng/mL，但该探针能在活体细菌中进行检测，为研究细菌硝基还原酶代谢循环提供了方法，也为创制含有硝基的芳香族农用化合物提供了一种观察与检测途径。RENPs 长寿命的特点使其非常适用于时间分辨生物荧光成像的研究，但是其检测能力大小与RENPs 大小和目标的结合率有关，而且水溶性与量子产率不高也是制约稀土发光纳米材料应用的关键问题[38-40]。

2 荧光探针技术

与传统荧光染料直接标记目的物质的原理不同，荧光探针技术是指使用荧光染料与研究对象结合后荧光染料荧光特性发生改变，利用荧光特性的差异分析研究对象的技术。荧光探针技术在医学、生物学等领域的应用，使得其作为一种热门标记技术应用于生命科学的各个研究领域，并取得了迅速发展。荧光探针技术具有非放射性、操作简便、高稳定性、高灵敏度和高选择性等特点，且荧光标记染料种类多、方法灵活，可应用于多种生物大分子及药物的标记[41]。

2.1 荧光探针结构及原理

荧光探针大多由三部分组成，荧光受体（Fluorescent receptors）、连接体（Spacer）、识别基团（Receptor）（图1）。当识别基团与被识别物质相结合时，荧光受体就会作出响应，表现出荧光强度的强弱、光谱的位移和颜色的改变等现象，从而可以观察并检测到研究对象的位置与数量。常见的荧光探针响应机制有荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）、光诱导电子转移（Photo-induced electron transfer，PET）、分 子 内 电 荷 转 移（Intramolecular charge transfer，ICT）、激 基 缔/复 合 物（Excimer-exciplex，ME）4种。

2.2 近红外荧光探针

近红外荧光探针是一类发射波长位于近红外区域（Near infrared，NIR）的荧光探针，不会被紫外-可见光波长区域的非靶标自发荧光物质影响，有较高的信噪比，并且具有荧光组织穿透能力强和对生物组织无光损伤等特点，受到各研究学者的关注，在近红外一区（NIR-1，700～900 nm）和近红外二区（NIR-2，1 000～1 700 nm）都产生了不少优秀的荧光探针。设计并开发具有稳定性强、水溶性好、安全性高且有较理想的发射波长和生物相容性的荧光探针成为最近近红外荧光成像的研究热点[42]。但是近红外荧光探针仍然有不少缺点，如光稳定性差、光漂白性差、细胞膜通透性差和细胞毒性等问题[43-44]，还需进一步发展。近红外荧光探针在新型农用化合物创制方面作为良好的体内成像探针被广泛应用，如生物体内的肠道微生物是近年农用化合物研发的热点，特定生物肠道内的菌群有良好的杀菌、杀虫[45-47]或影响害虫肠道内微生物[48]的作用，俞添贺[49]通过修饰近红外二区小分子荧光探针CQ，解决了探针细胞毒性和光稳定性差等问题，制作出能够特异性结合具有广谱杀菌作用的罗伊氏乳杆菌的荧光探针CQDB，运用荧光成像技术实时监测小鼠食用带有探针的罗伊氏乳杆菌后菌株在肠道中的定殖情况和运动轨迹，为后续对肠道内微生物的研究提供了思路。JIANG 等[50]设计了一种新型近红外荧光探针SQ，此探针可以特异性结合敌草快，稳定性和特异性高，通过荧光强度可以进行定量检测，并且能在斑马鱼体内生物成像，具有高组织穿透率和低细胞毒性，在斑马鱼体内可以实时定量检测敌草快的可信度，为联吡啶类农药创制提供了生物检测的新方式，具有很好的前景。虽然近红外荧光探针仍然存在不同组织穿透率不同、细胞内物质干扰等问题，但在农用化合物创制方面，利用近红外荧光探针技术对生物体内农用化合物进行实时定位研究具有准确、直观、损伤小等特点，能在细胞水平加深对药理学机制的理解。

2.3 荧光探针在新型农用化合物创制中的应用

新型农用化合物创制是一个长期的过程，从最初的先导化合物的设计与开发到最后农药的产业化生产过程中，活性物质筛选检测、化合物的作用位点与机制研究等方向都可以运用荧光探针来辅助验证试验结果，不仅缩短了新型农用化合物的开发时间，降低了开发成本，还能准确地验证试验结果。其中，作用位点及作用机制的创新是农用化合物创制最重要的难点和热点之一，近年来在潜在作用位点方面已经有很多的发现（表2）。

表2 农用化合物潜在作用位点Tab.2 Potential action sites of agricultural compounds

2.3.1 农用化合物活性物质筛选 荧光探针可结合特定基因片段或者受体蛋白，通过检测探针荧光强弱来筛选针对此基因片段或者受体蛋白的新型农用化合物，为新型农用化合物的活性物质筛选提供一种思路。荧光探针的结合方式如果设计不合理，将会导致荧光探针特异性不高，甚至对试验结果造成较大的影响，BAHMED 等[67]设计并合成了一种含丹磺酰荧光染料的几丁质合成酶（Chitin synthase，CHS）小分子荧光探针6-O-丹磺酰基-N-乙酰氨基葡萄糖（DNAG），通过定量检测DNAG 与CHS 结合后荧光的减弱强度，可以较为准确地评估CHS 的活性，且与放射性检测方法获得的结果一致，初步证明DNAG 在试验环境中是与CHS 特异性结合的，说明此荧光探针可以运用于针对几丁质合成酶的农用化合物筛选过程，但在后续筛选过程中，仍然需要注意试验环境是否会影响荧光探针的特异性，造成假阳性或者假阴性的结果。乙酰羟酸合成酶（Acetohydroxyacid synthase，AHAS）是一种分布于植物、细菌、真菌和藻类中但不存在于哺乳动物体内的催化缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸3 种支链氨基酸生物合成的关键酶，是广泛应用于多种农作物除草剂的作用靶点[68]。XIE 等[69]基于AHAS 的酶催化反应机制，利用苯甲醛衍生物作识别基团，成功设计了分子内电荷转移（ICT）荧光致变型小分子荧光探针probe-1。在probe-1与AHAS 特异性结合后，由于醛羰基对分子共轭体系的吸电子效应被打破产生荧光蓝移从而构建了适于快速发现AHAS靶向型除草剂的高通量筛选体系，为后续研究乙酰羟酸合成酶作用位点农用化合物提供支持。现阶段农用化合物活性物质筛选采用的方式依旧是对峙试验，这种方法只适合于不确定性的物质筛选，只能确定物质是否具有生物活性。荧光探针技术能定性定量检测并筛选出作用于目标物质的化合物，但在试验周期和成本上却不如传统方法，其更适用于通过计算机模拟设计和使用分子对接技术后已经确定作用于目标物质的活性物质检测，这样既能够验证计算机模拟的准确性，又能够检测活性物质的最佳抑制浓度，减少了活性物质的筛选时间，为后续作用机制研究提供了一些方向。但仍然需要注意荧光探针的设计合成过程较长和特异性等问题，理解并能自主设计探针是未来新型农用化合物创制的必备技术之一。荧光探针在农用化合物活性物质筛选方面的发展在解决上述问题后会更加迅速。

2.3.2 农用化合物作用位点及作用机制研究 在新型农用化合物创制方面，荧光探针可用于研究农用化合物作用机制和原理。荧光探针在作用位点与机制研究中可以通过与农用化合物活性物质连接来进行研究，但携带荧光探针的活性物质与原物质可能会在空间结构甚至理化性质方面不尽相同，自然不能够称为同种物质，需及时进行检验以保证荧光探针未对活性物质造成影响。李鑫[70]在研究有除草活性的4-羟基-3-甲氧基肉桂酸乙酯的作用机制时，设计合成了4-羟基-3-甲氧基肉桂酸乙酯查尔酮荧光探针LX-2，试验验证LX-2 不改变原化合物除草剂活性且除草症状一致，初步说明荧光探针对4-羟基-3-甲氧基肉桂酸乙酯暂无影响并且成功观察到LX-2 在拟南芥根和叶片中初步定位，阐述了4-羟基-3-甲氧基肉桂酸乙酯通过使幼根细胞壁加厚抑制根系吸收水分和营养物质以及激发拟南芥内叶绿素酶活性从而引起叶绿素的分解进而影响植物整体的生物合成途径来达到除草效果，完成了4-羟基-3-甲氧基肉桂酸乙酯作用机制的部分研究，为后续继续确定活性物质的结合位点和细胞内的作用机制提供了方向。王兰英[71]通过合成抗菌化合物天名精内酯酮荧光标记物（TTY）对小麦全蚀病菌进行细胞共定位研究，发现天名精内酯酮在细胞中的作用位点在线粒体，为后面天名精内酯酮靶点的研究做出了初步定位。在农用化合物的研究中常常涉及多个试验来验证活性物质的作用位点及相关机制，而作用位点的研究除了荧光探针法，常用的方法还有直接筛选法与间接筛选法[72]，直接筛选法中多种方法都需破坏细胞结构来提取活性物质结合受体，间接法则是通过活性物质作用后基因表达和细胞结构的差异来推断活性物质的作用位点，这2 种方法都不能直接验证出农用化合物在细胞内的作用位点，荧光探针则可以直观地展示农用化合物在生物体内的结合和运动轨迹以及聚集情况，为农用化合物作用原理的探究初步确定了思路和方向，大大缩减了农用化合物的创制过程，但是不同的农用化合物也需根据荧光染料自身光物理化学性质、农用化合物结构和目标生物特性综合考虑荧光探针的制作。合理有效利用荧光探针技术可以在农用化合物靶点和作用机制的研究中提供关键证据来验证试验猜想，不仅可以节约相关试验的成本，而且减少了农用化合物创制的时间。

3 免疫荧光技术

免疫荧光技术（Immunofluorescence，IF）是利用抗原和荧光染料标记的抗体特异性结合后识别待测物的分析技术，有直接法和间接法2 种形式（图2）。最常用的方法是间接法，其关键是抗体和二抗的用量预试验，不然会导致无荧光信号和假阳性情况的产生，如颜世君等[73]和罗俊等[74]运用免疫荧光技术间接法，分别检测了试验制备的非洲猪瘟病毒p22 蛋白的单克隆抗体和鸡异质核糖核蛋白AB（Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein AB，hnRNPAB）的单克隆抗体，结果显示，荧光标记二抗均能与各自单克隆抗体发生特异性结合并产生绿色荧光，证明2 个单克隆抗体制备成功。在新型农用化合物创制的过程中，运用到免疫荧光技术的分析方法有免疫荧光层析法（Fluorescent immunochromatography，FICA）、荧光偏振免疫技术（Fluorescence polarization immunoassay，FPIA）和时间分辨荧光免疫技术（Time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）等。

图2 免疫荧光技术原理示意Fig.2 Schematic diagram of immunofluorescence technology

免疫荧光技术常用在已知农用化合物的检测上，有快速、便捷和成本低等特点，在农用化合物创制过程中可以凭借这些特点对大量的待检测物进行筛选，也可以通过抗原抗体的特异性结合准确定位目标位置，但免疫荧光技术也有假阳性率高、定量误差大、背景干扰和检测限比色谱法检测高等缺点。近年来，通过不断的技术革新开发了更多不同的免疫荧光技术如荧光偏振技术，大大降低了检测时背景荧光的干扰等。

3.1 免疫荧光层析法

免疫荧光层析法是在免疫渗透技术基础上建立的固相标记分析技术，结合了免疫荧光分析技术和色谱层析技术的优点。其物化形式是免疫层析试纸条，主要由样品垫（Sample pad）、硝酸纤维素膜（Nitrocellulose membrane，NC 膜）、吸 水 纸（Absorbent pad）、PVC 底板组成。免疫荧光层析法具有检测时间短、操作简便、结果可视化、成本低廉等优点，在新型农用化合物创制过程中是进行大量鉴定与筛选的一种技术手段。GHOSH 等[75]等建立了一种新型柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）的免疫荧光层析检测法CTV-RT-RPALFICA，能够快速、即时、低成本诊断CTV，在针对CTV 的新型农用化合物创制前期也可对潜在农用化合物进行筛选，但免疫荧光层析法也会受到假阳性、灵敏度低等问题影响。未来在消除这些问题带来的影响后，免疫荧光层析法在新型农用化合物创制中将会有更加广泛的应用。

3.2 荧光偏振免疫技术

荧光偏振免疫分析技术是基于免疫竞争原理和荧光偏振原理的快速筛选分析技术，通过检测荧光标记抗原在结合特异性抗体前后的荧光偏振值变化来检测抗体。当检测物的温度和浓度一定时，荧光偏振值的大小只与荧光粒子的大小相关，解决了激发光强度波动给试验结果带来的误差问题，并且荧光偏振免疫技术还有着稳定性高、检测速度快和检测方法简单易于自动化等优点。荧光偏振免疫技术在新型农用化合物创制早期阶段中可用于潜在农用化合物大量且快速的筛选，如赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是由多种曲霉和青霉菌产生的一种有毒物质，HUANG 等[76]构建了一种基于FPIA 的玉米与大米中OTA 含量检测技术，该方法检测的OTA 质量浓度为0.03～0.78 ng/mL，IC50值为0.09 ng/mL，相较于其他免疫分析技术更加灵敏和快速，10 min 便能完成检测。此项技术通过改进可以快速地筛选出针对OTA 的广谱性抑菌农用化合物，在农用化合物创制后期也能够用于大田试验的效果检测，大大缩减了农用化合物的创制时间，也降低了相应的研发成本。

3.3 时间分辨荧光免疫技术

稀土离子螯合物具有荧光寿命较长（100～1 000 μs）的特点，在激发光停止后仍然会持续释放荧光，这种检测技术被称为时间分辨荧光。这种技术可以有效消除底物荧光的干扰，并且时间分辨荧光Stokes位移宽，螯合物的荧光发射峰狭窄，可通过波长分辨的方式进一步区别于背景荧光。以稀土离子螯合物作为抗原或抗体的标记物，将时间分辨荧光与免疫分析技术相结合的方法称为时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）[77]。TRFIA 在国内新型农用化合物创制方面的研究较少，而在农药残留检测方面应用广泛，如杜梅[78]建立了以镧系元素铕离子（Eu3+）作为荧光标记物标记抗体与二抗来检测土壤和糙米中吡虫啉的时间分辨荧光免疫技术PTRFIA-1 和P-TRFIA-2。其中P-TRFIA-1 的线性范围为0.02～2.3 ng/mL，最低检测限为0.02 ng/mL，P-TRFIA-2 的线性范围为0.017～0.24 ng/mL，最低检测限为0.017 ng/mL，灵敏度相比于此文献之前的时间分辨荧光免疫技术[79]提高了5 倍。在新型农用化合物创制中也可以运用到此项技术，将时间分辨荧光免疫技术与新型农用化合物抗体相结合便能够建立相应的检测技术，为新型农用化合物的残留检测试验提供一种新的思路。

4 讨论与展望

荧光标记技术在生物医学领域已经广泛运用于疾病诊断、癌细胞研究与追踪、药物开发等领域，而在农业领域，荧光标记技术运用最为广泛的方面是农药残留检测，在农用化合物创制方面的运用不多且不够深入，许多生物医学领域运用的最新荧光标记手段未能使用在农用化合物创制上，荧光染料的开发是荧光标记技术在农用化合物方面发展的方向之一。常见荧光染料凭借自身优良的荧光特性在医学、生物学等领域备受青睐，而特殊荧光染料也在不断地被修饰改造，增加自身的优点，完善自身的不足，这些荧光染料在新型农用化合物的创制中也有着不可或缺的作用。但是荧光染料自身仍然有光漂白、细胞毒性和荧光持续时间短等缺点。寻找具有特定光物理化学特点的新式荧光染料或不断修饰与改造常见荧光染料创造出功能更强、特异性更高、更加简单精确的荧光染料是现今荧光染料开发的研究热点。

针对农用化合物的荧光探针设计也在不断发展。为了减少荧光染料本身的缺点，在荧光探针的设计上仍然要做许多工作以改进荧光染料特定的性质或绕过它们本身的局限性。在新型农用化合物创制方面，荧光探针能够给研究者提供生物体内清晰准确的图像及数据，为农用化合物的筛选及作用机制研究提供快速便捷的技术。尽管荧光探针对于新型农用化合物创制有着独特的作用，但是其暴露出的不足仍然明显，细胞毒性、灵敏性低、背景光源的干扰、荧光强度不足及成本较高等问题都不可忽视，设计出简单经济、荧光强度高、灵敏度高、稳定性强和穿透力高的荧光探针仍是研究者不断追求的目标。现在，近红外区域荧光探针凭借着高信噪比和强荧光穿透力成为生物活体成像领域的研究热点，未来荧光探针活体生物成像技术将会更多地应用于新型农用化合物创制方面。

免疫荧光技术在新型农用化合物创制过程中最常应用在对农用化合物目标物质的检测中，在已知农用化合物检测领域中也有着重要作用，是农用化合物检测的常用手段之一。目前，荧光标记技术中仍然存在几个关键问题亟待解决：一是不同试验设计中试验环境与要求常会造成荧光染料的选择困难，同时无法准确地预测荧光染料的修饰结果，对荧光染料与待测物质结合往往还需考虑特异性问题；二是荧光探针的设计与免疫荧光中抗原抗体的制作都需耗费大量的时间与成本；三是荧光探针需将分析物质连接于检测物质上，可能造成检测物质光物理化学性质的改变，使得试验结果不能直接证明研究猜想，仍需要相关辅助试验结合才能完整证明。相信，随着荧光标记技术的不断成熟、优化，荧光染料修饰方法将逐步得到完善，重组抗体的研究也将极大缩短抗体的制备周期，这将为加速新型农用化合物创制提供坚实的基础。