酒精性肝病动物模型的研究现状及展望

刘梦佳,连奕琪,吕翼

(福建师范大学生命科学学院,福建省发育与神经生物重点实验室,福州 350117)

酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是一类由于长期大量饮酒导致的肝代谢疾病,它严重危害人民的身体健康并给社会生活带来巨大的经济负担[1-2]。随着人民生活水平的提高和生活方式的改变,我国嗜酒者的比率在逐年上升,酒精已成为继病毒后导致肝损伤的第二大病因[3]。ALD 早期主要呈现的病理改变是肝细胞内发生脂肪变性,如不干预则进一步会发展成肝炎、肝纤维化、肝硬化,甚至肝癌[4-5],酒精已然成为威胁我国公共健康的重要因素之一。除此之外,饮酒导致的医疗消费也给患者家庭带来了巨大的经济负担。ALD 患者根据病情的严重程度每人每月所需的治疗费用为500～ 10 000元[6]。虽然早期的ALD 患者可以通过戒酒使病情得以改善甚至逆转,但对于中晚期患者目前临床上仍没有治疗的特效药物,而对于肝硬化晚期的患者,唯一行之有效的治疗手段则是肝移植,但是目前肝源的短缺及肝移植的昂贵费用严重制约着手术的开展[7-8]。肝是一个“沉默”的器官,由于缺乏痛觉神经以及代偿功能强大,在ALD 早期往往不会出现明显的疼痛感以及肝功能失常的症状。这就使得ALD 在发现时就往往已经处于疾病的晚期阶段,从而引发一系列的并发症并造成高死亡率。2015 年我国约16 万人死于酒精相关终末期肝病,其中约3 万人死于酒精性肝硬化,约13 万人死于酒精相关肝癌[9-10]。另外根据世界卫生组织2016 年的调查数据显示,每年由于饮酒导致的相关死亡人数为300 多万,占全球所有死亡人数的5.3%[11]。由此可见酒精对人体的毒害作用不容小觑,开发早期诊断标志物来评估个体对ALD 的易感性以及研究出新的、有效的ALD 治疗药物或治疗措施是目前亟待解决的问题。

近些年随着现代分子生物学及基因组学的发展,对ALD 发病机制也有了进一步的认识[12]。然而到目前为止尚未开发出确切的早期诊断工具,也还未成功研发出预防和有效治疗ALD 的特效药物,形成这一局面的部分原因是目前的动物模型还不够完善。一个行之有效的动物模型不仅可以用来研究ALD 不同阶段的发病机制,还能提高发现新的治疗靶点的机率,也能加深对于酒精性肝损伤的认识。而目前已知的酒精肝模型,没有一个模型可以概括人类ALD 的整个进程,这严重制约着对ALD的认识及研究进展[13]。本文综述不同影响因素对ALD 动物模型建模的影响和目前常见ALD 模型的优缺点,并根据目前最新的研究进展提出相应的建模思路,以期能更好地完善和补充ALD 动物模型的病程涵盖范围,为该领域的发展提供借鉴。

1 影响因素

早在20 世纪50 年代研究者就开始使用啮齿类动物和灵长类动物作为动物模型来研究ALD[14]。灵长类动物与人类的ALD 的病理阶段非常相似,是公认的研究ALD 最理想的模型。但是由于伦理问题以及目前对灵长类动物使用的严格管控和成本等阻止了灵长类动物被广泛应用于ALD 的研究。因此,目前研究ALD 首选动物仍是啮齿类动物,但实际上有很多因素会影响到啮齿类模型的建成,如品种、性别、年龄等。接下来本文将从以下几个方面对建模的影响因素进行具体的综述。

1.1 品种

研究发现与西方国家的人相比,亚洲国家的人乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)的活性普遍较低,因此在同样的饮酒情况下,亚洲人的肝更容易受到酒精的毒害[15]。同样,酒精对不同品系鼠的肝造成的损伤也具有显著性差异。转氨酶是肝细胞损伤的敏感标志[16]。ICR 小鼠灌胃1 次体积分数为50%的乙醇溶液(14 mL/kg),处死后发现血液中丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)及天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)含量与空白对照组相比提高了1倍[17]。以同样的方式给予129/Sv 小鼠体积分数为30%的乙醇溶液(6 g/kg)灌胃处理后,与空白对照组相比ALT、AST 含量提高了4倍[18]。而同样的处理只能引起C57BL/6 小鼠血液中ALT 和AST 轻度升高[19]。而在大鼠中,与对照组相比,使用40%的乙醇溶液(8 g/kg) 灌胃的雄性Wistar 大鼠和使用52%乙醇溶液(8 g/kg)灌胃的雄性SD 大鼠处死后血液中升高的转氨酶的倍数几乎相同[20-21]。说明不同品系的大、小鼠对酒精的耐受程度是不同的,有些品系的大、小鼠在较低浓度的酒精作用下就能产生的明显的肝损伤,而有些品系的大、小鼠则需要更高的酒精浓度。在建模前从品种、期望性状、实验结果出发对不同品系的小鼠进行筛选是必要之举。如ICR 小鼠生长繁殖快,对环境的适应性和疾病的抵抗力强,可以用此品系的小鼠进行相关药物的开发。C57BL/6J 小鼠嗜酒精性高,对酒精耐受强,如果要建立长期模型适宜选用此品系的小鼠来建模。

1.2 年龄

随着年龄的增大,人类的肝结构、肝窦及功能发生改变,造成肝功能下降,导致了一系列与年龄有关的肝病的发展[22]。越来越多的证据表明酗酒者患酒精性肝病的风险与其年龄大小有关[23]。研究发现在啮齿动物中也存在相同的患病趋势。当分别以C57BL/6 老年小鼠(>16 个月)、中年小鼠(12～ 14 个月)、青年小鼠(8～ 12 周)为实验对象来探究年龄与酒精性肝损伤之间的关系时,发现在同样的喂养模式下,与青年小鼠相比,老年小鼠血清中转氨酶的含量更高、脂肪变性更严重、并且观察到明显的肝中性粒细胞浸润以及纤维化[24]。而当加大剂量和延长喂养周期时,老年小鼠的肝呈现典型的酒精性肝纤维化改变,而中年小鼠只是增加了纤维化反应有关的mRNA 的表达,并没有肝纤维化发生[25]。这些都说明在相同的喂养条件下老年小鼠的炎症程度更深,并且随着喂养周期的延长,老年小鼠的疾病进程更容易向纤维化发展。虽然老年小鼠很容易诱发肝炎症及肝纤维化,但是随着年龄的增大,小鼠自身的身体状况对建模也会有很大的影响,因此在建模时选择合适年龄的小鼠是一个十分重要的问题。

1.3 性别

随着女性社会地位的提升,女性的饮酒比例逐年上升,而对于同样的饮酒量,女性患酒精肝的风险却高于男性[26]。在一些小鼠中实验也发现雄性小鼠似乎比雌性小鼠更能抵抗乙醇喂养引起的肝损伤。众所周知,慢性+狂饮的饮酒模式会导致显著的肝损伤,采用此种模式喂养的C57BL/6 小鼠雌性小鼠血清中的ALT 和AST 水平明显高于雄性小鼠[27]。对这种现象进行深入研究发现,与喂食相同酒精含量的雌性小鼠相比雄性在应激环境下表达了更多对蛋白质有保护作用的热休克蛋白27/70,同时对肝细胞有保护作用的IL-6 信号通路的激活更强,肝细胞增殖加快,这一系列因素减弱了酒精对雄性小鼠肝的损伤,弥补了由于酒精刺激导致的肝细胞的损失,使得雌性小鼠的肝损伤比雄性小鼠的更严重[28]。另外有研究表明雌激素是ALD 的辅助致病因子,因为与分泌正常激素水平的雄性小鼠相比,分泌高雌激素和低睾酮的雄性小鼠的肝损伤明显加重。而在日常中无论酒精摄入量如何,雄性小鼠的血清雌激素水平总是低于雌性小鼠,也就导致雌性鼠的肝损伤易感性更强[29]。不同性别小鼠的生理情况不同,激素分泌水平也有所区别,而且小鼠的肝重量在性别之间也存在明显差异[30]。尽管更明确的影响因素还不确定,但是就目前的研究发现而言,雌鼠对ALD 的易感性更强,因此在选择小鼠来研究乙醇诱导的肝损伤时要注意考虑性别的影响。

1.4 酒精性饮料类型

随着生活水平的提高,人们日常生活中可获取的酒精饮品的类型也越来越丰富多样,常见的有白酒、葡萄酒、黄酒、啤酒等。饮用不同类型的酒精饮料对人体的伤害有着不同的差异,如在摄入相同酒精的情况下,葡萄酒饮用者患肝硬化的风险低于白酒和啤酒饮用者[31]。这是因为葡萄酒中的非酒精成分具有抗氧化的特性,从而降低酒精对肝的损伤[32-33]。在小鼠中控制酒精的摄入量相同,分别喂食啤酒(酒精浓度≥5% vol)、黄酒(酒精浓度≥10% vol)、红葡萄酒(酒精浓度≥12.5% vol)和白酒(酒精浓度≥56% vol),发现白酒组小鼠肝脂肪样变和气球样变最为严重,啤酒组最轻,并且白酒组还出现了严重的肝细胞坏死[34]。表明在饮用相同量的酒精的情况下高浓度的酒精饮料对肝的伤害更大。这可能是因为大量低浓度的酒精饮料在代谢过程中是水和酒精一起代谢的,当血容量扩增时,血液中的酒精浓度偏低,在产生相同乙醇脱氢酶和ALDH 的情况下,酒精代谢得更彻底,所以对肝的危害更小。研究者在选择酒精饮料造模时要根据ALD 不同阶段的情况和实验条件选择合适浓度的酒精饮料,以达到最佳的造模效果。

1.5 饮食

除了上述几种影响因素外,还有很多其他因素也会影响建模的效果,如饮食、饮酒方式等,饮酒方式会在下文详细探讨,对于饮食来说,饮食中微量元素的缺乏、高脂食物等会一定程度的影响酒精性肝病的发生进程。如锌的缺乏通过损害肠道屏障,使肝中内毒素含量升高,诱导一系列炎症因子的产生最终引发肝炎症[35]。而微量元素镁缺乏也会加剧酒精诱导的肝损伤[36]。高脂饮食会增加肥胖的机率,并且与非高脂饮食的酒精小鼠相比,高脂饮食的酒精小鼠血清ALT 水平更高,增加了患脂肪性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的风险[37-38]。另外胆碱具有促进脂肪代谢和降低血清中胆固醇的作用,喂食缺乏胆碱的饮食会使得大鼠出现一定程度的脂肪变性,若进一步反复暴饮酒精则会引发肝纤维化[39]。所以,研究者在建模时要提供足量的营养支持,并且要平衡好各组动物的摄入热量,以防出现建模不理想的状况。

2 典型建模方式

研究表明,饮酒方式显著影响人类酒精性肝病的发病机制,酒精摄取的剂量以及持续时间会影响酒精性肝病的严重程度。目前应用广泛的喂养模型有急性酒精灌胃模型、慢性酒精喂养模型、慢性+暴饮模型、胃内灌注模型以及“二次打击”模型(见表1)。

2.1 急性酒精灌胃模型

为了克服小鼠天生对酒精的厌恶,研究者开发了一个酒精灌胃模型,直接给小鼠进行一定剂量的酒精灌胃。此方法可导致小鼠体内血液酒精浓度(blood alcohol concentration,BAC) 水平逐渐升高[40]。给小鼠进行一次30%的酒精(6 g/kg)灌胃,1.5 h 后发现与对照组相比,酒精组小鼠BAC 增加了4 倍多,内毒素水平增加了6 倍,肝细胞轻度坏死[18,41]。当给小鼠进行3 次酒精灌胃时,小鼠肝出现明显的泡状脂滴聚集并伴随炎症灶的产生[52]。急性酒精灌胃模型可以模拟没有饮酒史的人群一次暴饮后酒精对肝的损伤,以及辨别急性肝损伤与慢性肝损伤的区别。该模型因为造模时间短,操作简单,在研究酒精性肝损伤的相关药物方面有很大的应用空间。但是该模型的缺点也是显而易见的,只能引起血清中AST、ALT 轻微升高以及轻度的脂肪变性,不能模拟更严重的肝损伤形式。

2.2 慢性酒精喂养模型

目前应用最多的慢性酒精喂养模型是由科学家Lieber等[53]创立的Lieber-DeCarli 液体饮食模型。用加工成粉末的饲料加水勾兑成液体饲料,对于酒精组小鼠来说则是在液体饲料中添加一定浓度的酒精,让小鼠每天有一定量的酒精摄入。这个模型很好的模仿了人类慢性饮酒的模式。10 d 酒精饲料喂养,能引起小鼠血清ALT 和AST 轻度升高,但是差异不显著[19]。而当慢性酒精喂养延长到4 周时,小鼠肝出现了明显的脂肪聚集,还伴有微囊泡和大囊泡脂肪变性,血清中ALT 和AST 显著升高[42-43]。有趣的是,当这种喂养延长到16 周时,通过组织切片可以观察到酒精组小鼠肝内有大量脂滴聚集,肝中甘油三酯(triglyceride,TG)和总胆固醇(total cholesterol,TC)的含量是对照组的4倍[35]。该模型可以规避小鼠天生对酒精的厌恶情况,并且小鼠死亡率低、操作简单,同时可以发现随着酒精饲养时间的延长肝的损伤也越来越严重。但是可能因为小鼠的摄食时间长,该模型只是停留在ALD的早期,只会导致轻微的脂肪变性以及少量的炎症而更严重的纤维化则没有出现。

2.3 慢性+暴饮模型

前人的研究已经揭示慢性酒精摄入或急性重复狂饮只会导致肝轻微脂肪变性。但是大多数因肝病住院的患者都是近期有暴饮现象的酗酒者,这类饮酒模式是进一步增加肝损伤的诱因。高斌团队开发出的慢性+暴饮模型也即Gao-binge 模型很巧妙的模拟的这类饮酒模式[54]。笔者团队先前的研究发现,10 d 慢性饮酒+一次暴饮可以给小鼠肝造成典型的损伤如:显著升高的血清转氨酶水平、TG 水平、TC 水平等[55],这与Shukla等[44]的实验结果是一致的。另外在4 周的慢性饮酒+2 周的酒精灌胃模型中,小鼠的肝小叶中心静脉周围出现明显的脂滴聚集和炎性细胞浸润[56]。而肝内炎性细胞浸润是肝炎的一个显著临床特征,与酒精性肝炎的发生密切相关[45,57]。当将慢性乙醇喂养期延长至8～ 12 周,并也加上单剂量或者多剂量乙醇灌胃后发现该模型引起更严重的酒精性脂肪肝炎(alcoholic steatohepatitis,ASH)和轻度肝纤维化[19]。该模型是结合Lieber-DeCarli 液体饮食模型和口服灌胃模型来模拟大多数肝病患者的饮酒模式,它不仅操作简单,而且还能够诱导产生更高水平的脂肪变性、血清ALT 和肝炎症反应,在ALD 发病机制及新的治疗靶点的开发中得到广泛的应用。

2.4 胃内灌注模型

胃内灌注模型是T-sukamoto-French 开发的一种通过手术在胃内插管直接输注的喂养模式,也称TF 模型[58]。这个模型需要在鼠的颈后部和腹中部各做一个皮肤切口,导管从颈后部的皮肤切口进入,插进前胃,通过导管来控制鼠的酒精摄入[16]。该模型可以通过导管随意控制食物的种类和含量,以创建所需的肝损伤模型。研究表明在灌注4 周时就能出现高水平的酒精中毒,表现为BCA 的含量达到350 mg/dL,有的甚至超过400 mg/dL[46]。如果加大酒精的摄入量并联合高脂饮食培养,大鼠在4 周内就会开始出现肝纤维化,当培养到16 周时所有的实验大鼠都能观察到肝纤维化[47]。若在该情况下继续在食物中添加羰基铁,有少数大鼠则会发展为肝硬化[59]。虽然TF 模型可以通过导管使体内保持较高的酒精含量以及更改食物参数从而产生一系列肝损伤,如肝脂肪变性、肝硬化等,但是建立该模型需要很高的人力和物力成本,如高超的手术操作能力、严格的术后护理,以防止鼠在建模初期因感染致死,另外在造模过程中也要密切监测鼠的健康状况以及生理体征。这些严苛的条件限制了该模型的广泛运用。

2.5 “二次打击”模型

大多数研究表明,单纯的酒精诱导只能诱发肝脂肪变性或者轻度的肝炎,而对于更严重的肝炎或是肝纤维化都不能用单纯的慢性酒精来诱导。因此有研究者开发了二次打击模型,即在酒精诱发肝产生一定损伤后,再次引入另外一种因素来达到加速肝损伤的目的[60]。四氯化碳单独作用不能引发肝纤维化,但当它和酒精联合使用时可以引发明显的肝纤维化以及中度炎症,并且该模型与人的酒精性肝纤维化和炎症的关系模式基本相似[48,50-51]。另外,小鼠以高脂+急性酒精暴食的方式喂养3 d就会导致肝损伤以及观察到中性粒细胞浸润,当这个喂养时长延长至3 个月时则会引发严重的脂肪性肝炎[49]。除了以上因素外还可以通过注射脂多糖、喂食缺乏胆碱的饮食等来获得更严重的肝损伤模型[39,61-62]。概括来说,“二次打击”模型可以很容易的诱发肝炎和肝纤维化,但是其局限性也很明显,因为它存在非酒精性因素,所以所取得的结果可能与单纯酒精诱导的病变有所不同,对其病变机制的阐述也应更加谨慎。

3 新型建模方式

随着科学技术的发展,基因编辑已经成为建立人类疾病动物模型的重要手段,研究者可以通过向动物添加外源基因信息或者敲除某些内源基因以达到促进或抑制某些疾病相关基因表达的作用。过表达细胞色素P4502 酶1(cytochrome P4502E1,CYP2E1)基因的酒精小鼠体内与细胞结构和重组有关的基因表达增多(如角蛋白8,细胞角蛋白8 是Mallory 小体中的主要角蛋白之一,它体现着酒精性肝病和酒精性肝炎的特征[63])而与代谢相关的基因表达减少(如胆固醇代谢),并且还能观察到炎症灶[64]。这说明过表达CYP2E1 会加重肝损伤,如果要达到治疗ALD 的目的或许可以从抑制该基因表达或者敲除其入手。另外对表观遗传调节因子去乙酰化酶6(sirtuin 6,SIRT6)基因进行修饰,发现SIRT6 敲除的酒精小鼠出现严重的肝损伤,尤其是氧化应激和炎症显著增加。同时与酒精性肝炎患者一样,EF-Sirt6 KO(ethanol-fed sirt6 knockout)小鼠肝中金属硫蛋白(metallothionein,MT)1 和2 基因表达下调。当进一步在肝中过表达Mt1 则发现可以显著改善Sirt6 KO 小鼠由于酒精导致的肝损伤。而在肝中过表SIRT6 也会出现与过表达Mt1 同样的现象,这表明Sirt6 及Mt1 和Mt2 的表达增强了肝防御系统对酒精毒性的抵抗力[65]。在未来SIRT6 很可能成为酒精肝的一个有效的治疗靶点。基因编辑模型运用基因编辑技术不仅可以针对实验动物全身进行基因编辑,也能特异性的针对某个组织、器官进行编辑,从而高效的对ALD 进行研究,精准的掌握ALD 的发病机制以及相关代谢通路,为寻找新的治疗靶点提供新途径。而它的缺点在于不能预见相关基因的敲除或过表达是否会对实验动物产生致命性伤害,如早死、胚胎致死等。

4 未来可能的建模方向

慢性+暴饮模型可以很好的建立ASH 模型,引发严重的中性粒细胞浸润。而ASH 患者的严重程度和死亡率与中性粒细胞浸润程度显著相关。在酒精处理的小鼠中,肝细胞和肝星状细胞会产生大量趋化因子配体1 (chemokines 1,CXCL1)[66]。CXCL1 是中性粒细胞募集趋化因子,它通过趋化因子受体2 促进中性粒细胞渗入肝,增加肝中性粒细胞浸润,加剧肝损伤。Hwang等[67]在高脂饮食(high-fat diet,HFD) 喂养的小鼠肝中过表达CXCL1,发现过表达小鼠肝中性粒细胞浸润增加,并且促进了脂肪变性到非酒精性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)这一进程,而正常饲料喂养的CXCL1 肝过表达小鼠可能因为缺乏脂肪变性和纤维化并没有产生NASH 表型。另外在HFD-CXCL1肝过表达小鼠中还发现了与人类同源的48 个炎症和纤维化基因表达的上调,这种建模方式完整的模拟了人类NASH 的表达谱。未来也许可通过EtOHCXCL1 肝过表达来建立酒精性肝炎模型,从而完整模拟人类ASH 的表达谱和寻找潜在的治疗靶点。

5 总结与展望

综上所述,小鼠的品种、年龄、性别、饮用酒精的类型对酒精性肝损伤有不同程度的影响,今后设计和解释酒精性肝病动物模型时应考虑这些因素以选择到合适的小鼠品种[68]。小鼠以不同方式摄入酒精会对肝产生不同程度的损伤,每种模式都有其优点和局限性,根据实验的需求选择合适的喂养模型会给实验进程带来事半功倍的效果。需要注意的是啮齿类动物和人类在生理学和病理学方面存在明显的物种差异,如啮齿类动物酒精分解速度是人类的5 倍、啮齿类动物更能抵抗内毒素带来的炎症反应等,如果要达到与人类相同的肝损伤可能需要更大的酒精刺激,所以不能直接将小鼠的结果转换成人类的结果[69]。

不同模型以其自身的特点应用于不同程度和不同阶段的ALD 的研究,是ALD 的发病机制、诊断、预后、标志物和治疗靶点的有力研究工具。目前已经建立的ALD 动物模型还不能复制人类ALD全谱,而晚期ALD 如纤维化和肝硬化也不能仅仅通过酒精来诱导,需要通过继发性的损伤才能实现,所以我们还需要改进和开发新的ALD 模型,从而在更大相关程度上模拟人类的ALD谱[70]。