亚硝酸盐胁迫对盐蚕豆虫生长与抗氧化能力的影响

齐红莉,吕湘琳,刘家乐

(天津农学院水产学院天津市水产生态及养殖重点实验室,天津 300392)

亚硝酸盐是水生生态系统中氮循环的自然组成部分,是一种常见的环境污染物[1-2]。在天然水体中,亚硝酸盐通常保持在较低质量浓度(<0.02 mg·L-1)[3-4],随着近年来含氮污水、集约化养殖、高氮排泄物和高投饵量的影响,水体中亚硝酸盐质量浓度急剧增长。在废水中,亚硝酸钠质量浓度可达到90 mg·L-1的水平[5]。此外,在水生生物集约养殖的水域中,亚硝酸盐增加,其中在封闭的金鱼(Carassiusauratus)幼鱼循环养殖系统中亚硝酸盐质量浓度为0.24～0.30 mg·L-1[6];工业化养殖南美白对虾(Penaeusvarlnamei)水体中亚硝酸盐质量浓度可达4.70 mg·L-1[7]。高浓度的亚硝酸盐是引发水生生物压力的潜在因素,对水生生态系统中亚硝酸盐的生态毒性研究引起了学者的关注[8]。

纤毛虫被广泛认为是环境风险早期预警的指示生物,它们独特的生物特性,如高度多样性、生命周期短、世界性分布、易于收集、数量大以及对环境干扰反应迅速[5]。此外,纤毛虫作为评估污染物毒理效应的模型生物[9-11]。盐蚕豆虫(Fabreasalina)隶属于纤毛虫门(Ciliophora)多膜纲(Polyhymenophora)异毛目(Hetootricha)蚕豆虫属(Fabrea)。其环境适应性强,繁殖周期快,作为海洋鱼类幼鱼阶段的活饲料可进行大规模养殖[12-14]。氮营养盐可被原生动物利用,但高浓度的氮营养盐可对其产生胁迫作用。纤毛虫对亚硝酸盐的耐受性较高,是富营养浮游生态系统反硝化的主要贡献者[15-16]。因此,探究氮对原生动物的作用将为揭示原生动物对水体营养化水平的响应机制提供依据。

本文以盐蚕豆虫为材料,研究亚硝酸盐对盐蚕豆虫的毒理学作用,以确定环境中氮营养盐变化对盐蚕豆虫的种群动力学特征和抗氧化酶系统的影响,为原生动物对亚硝态氮胁迫的响应机制提供数据支持,为水生生态环境的亚硝态氮污染的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

盐蚕豆虫(F.salina)采自天津市北大港沿岸湿地[17]。试验前,使用盐度为50 g·L-1的灭菌人工海水进行培养[18],以商业干酵母为食,在温度(28±1)℃、光照度2 000 lx、光/暗培养时间为14 h/10 h恒温培养箱中扩大培养,当其密度达到4×104个·L-1时,开展试验。

1.2 试验方法

1.2.1 亚硝酸钠胁迫毒性试验采用水生生物毒性试验方法[19],预试验测定出亚硝酸钠对盐蚕豆虫的96 h半致死浓度(LC50)为2 358.27 mg·L-1,最低有效浓度(LOEC)为154 mg·L-1。以96 h LOEC为最大浓度,按等对数间距法设置正式试验浓度,分别为:0、9.63、19.25、38.50、77.00和154.00 mg·L-1。在六孔细胞培养板中,每孔加入3 mL盐度为50 g·L-1的人工海水,盐蚕豆虫的接种密度为4 个·mL-1,每隔24 h于解剖镜下观察计数盐蚕豆虫的种群密度[20],每个质量浓度组重复3次,计数重复2次,计数误差不超过15%。

1.2.2 抗氧化酶活性的毒性试验参考Li等[21]的方法,将盐蚕豆虫转移到设置好浓度的处理组中用于药物处理试验。以亚硝酸钠对盐蚕豆虫的96 h LC50的1/10为最大浓度,按等对数间距法设置的亚硝酸钠质量浓度为0、91.0、153.0和235.8 mg·L-1。在50 mL锥形瓶中进行试验,每个处理重复3次,盐蚕豆虫的密度约为1×106个·L-1。不同处理组,在不同间隔时间点(12、24、36和48 h)用5 μm孔径的滤膜于真空泵中抽滤并分别收集待测定盐蚕豆虫,随后在研钵中加入1 mL裂解缓冲液进行粗酶提取,全过程在冰浴中完成。将研磨好的样品在4 ℃、3 000 r·min-1离心5 min,取上清液,按照南京建成试剂盒说明测定盐蚕豆虫抗氧化酶活性(SOD、CAT、POD、GPx、总蛋白)。

1.3 种群动力学参数及综合生物标志物响应指数(IBR)的计算

原生动物的比生长率(μ)根据式(1)[22]计算,世代时间(G)与比生长率(μ)之间的关系根据式(2)计算,综合生物标志物响应指数(IBR)值根据Kim等[23]的方法计算:

μ=[ln(Ct)-ln(C0)]/t

(1)

G=ln 2/μ

(2)

式中:μ为比生长率,即假设纤毛虫的生长为指数生长时的生长率[24];C0为初始纤毛虫的种群密度;Ct为时间t时纤毛虫的种群密度;t为试验时间(d),即纤毛虫指数生长期的持续时间;G为世代时间。

1.4 数据分析与处理

采用Excel 2010软件进行数据处理和图表绘制,数据以平均值±标准差表示,应用SPSS 23软件对数据进行分析,采用单因素方差(one-way ANOVA)对种群生长参数以及抗氧化酶活性数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 亚硝酸钠对盐蚕豆虫种群生长的影响

不同质量浓度亚硝酸钠胁迫显著影响盐蚕豆虫的种群生长(P<0.05)。亚硝酸钠处理1 d,盐蚕豆虫生长处于停滞期,然后种群生长进入指数增长期并呈现出明显的差异,5 d后达到最大种群密度,38.50和154.00 mg·L-1处理组盐蚕豆虫的种群生长于2 d的稳定期后进入衰退期,其他处理组稳定期不明显(图 1-A)。盐蚕豆虫的最大种群密度随亚硝酸钠质量浓度的增加呈先上升后下降的趋势(图 1-B)。与其他处理组相比,9.63、19.25 mg·L-1处理组盐蚕豆虫的最大种群密度升高,其中9.63 mg·L-1处理组盐蚕豆虫的最大种群密度显著高于对照组,显著促进盐蚕豆虫的种群生长(P<0.05)。而38.50、77.00和154.00 mg·L-1处理组盐蚕豆虫的最大种群密度则显著低于对照组(P<0.05),抑制盐蚕豆虫的种群生长。

图1 盐蚕豆虫在不同质量浓度亚硝酸钠胁迫下的种群密度(A)和最大种群密度(B)Fig.1 The population densities(A)and maximum population densities(B)of Fabrea salina underdifferent concentration of sodium nitrite stress不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。下同。Different small letters indicate significant differences at 0.05 level among treatment groups. The same as follows.

从表1可知:各处理组的盐蚕豆虫比生长率呈现先升高后降低的趋势。与对照组相比,9.63 mg·L-1处理组盐蚕豆虫的种群生长率增加了8.8%,而19.25、38.50、77.00和154.00 mg·L-1处理抑制盐蚕豆虫的比生长率,其中154.00 mg·L-1处理抑制作用最强,比生长率显著下降了20.59%(P<0.05)。各处理组的盐蚕豆虫的世代时间呈先缩短后延长的变化趋势,世代时间的峰值出现在154.00 mg·L-1处理组(P<0.05),最低值出现在9.63 mg·L-1处理组。

表1 盐蚕豆虫在不同质量浓度亚硝酸钠胁迫下的比生长率(μ)和世代时间(G)

2.2 亚硝酸钠对盐蚕豆虫抗氧化酶活性的影响

从图2可知:亚硝酸钠胁迫下,12、24和48 h时盐蚕豆虫SOD活性随亚硝酸钠质量浓度的增加呈先升高后降低的趋势。24 h时,不同质量浓度亚硝酸钠胁迫下SOD活性变化不显著(P>0.05);36 h时,亚硝酸钠处理组的SOD活性显著低于对照组(P<0.05)。12和24 h时盐蚕豆虫CAT活性呈先上升后下降的趋势,91.0和153.0 mg·L-1处理组盐蚕豆虫CAT的活性均显著上升,并在24 h达到峰值,分别为对照组的4.32倍和4.55倍(P<0.05);在36 h时,CAT活性与对照组水平相当(P>0.05)。12和24 h时,盐蚕豆虫的GPx活性总体上呈先上升后下降的趋势;36 h时,153.0和235.8 mg·L-1处理组盐蚕豆虫的GPx活性显著增加(P<0.05)。盐蚕豆虫POD活性随亚硝酸钠质量浓度的增加而增加,高浓度处理组(153.0和235.8 mg·L-1)盐蚕豆虫的POD活性显著增加(P<0.05),而低浓度处理组(91.0 mg·L-1)的POD活性与对照组相比无显著差异(P>0.05)。

图2 盐蚕豆虫在不同质量浓度亚硝酸钠胁迫下的抗氧化酶活性Fig.2 Antioxidant enzyme activity of F.salina under different concentration of sodium nitrite stress

2.3 亚硝酸钠对综合生物标志物响应指数(IBR)的影响

在亚硝酸钠胁迫下,不同处理时间盐蚕豆虫的剂量-效应分析见图3。153.0和235.8 mg·L-1处理组中IBR值随处理时间的延长呈先下降后上升的趋势,91.0 mg·L-1处理组在不同处理时间下变化不明显,并且始终低于对照组。12 h时,高浓度组(153.0和235.8 mg·L-1)IBR值高于低浓度组(0和91.0 mg·L-1),153.0 mg·L-1组于24～36 h时下降,且低于对照组,48 h时增加。235.8 mg·L-1处理组36～48 h时IBR呈上升趋势,高于其他处理组。

图3 盐蚕豆虫在不同质量浓度亚硝酸钠胁迫下的整合生物标志物响应指数(IBR)的变化Fig.3 Changes of integrated biomarker response(IBR)ofF.salina under different concentration ofsodium nitrite stress

生物标志物响应指数(IBR)星状图见图4。由4种生物标志物(SOD、CAT、GPx、POD)响应得分构成的星状图面积即为IBR值,星状图面积越大则代表亚硝酸钠胁迫对盐蚕豆虫的毒性越大。12 h时,SOD对星状图贡献最大,与对照组相比,153.0 mg·L-1亚硝酸钠处理组星状图覆盖面积最大;24 h时,CAT对星状图贡献最大,0和153.0 mg·L-1处理组星状图面积较大,91.0和235.8 mg·L-1处理组对GPx和CAT响应较小;36 h时,不同浓度亚硝酸钠对生物标志物的响应情况不同,0 mg·L-1处理组主要引起SOD的响应,235.8 mg·L-1处理组主要引起GPx和POD的响应,其中235.8 mg·L-1处理组星状图面积最大,153.0 mg·L-1处理组星状图面积最小;48 h时,与对照组相比各亚硝酸钠处理组抑制GPx的响应,引起CAT和SOD响应,235.8 mg·L-1处理组星状图面积最大,IBR值最高。

图4 盐蚕豆虫在不同质量浓度亚硝酸钠胁迫下的IBR星状图Fig.4 IBR star plots of F.salina under different concentration of sodium nitrite stress

3 讨论

3.1 亚硝酸钠对盐蚕豆虫种群生长的影响

纤毛虫种群生长均符合逻辑斯蒂增长曲线,即细胞在进行分裂前都有一段停滞期,随后进入指数生长期、稳定期及衰退期[25]。本试验结果显示,盐蚕豆虫在不同质量浓度亚硝酸钠水体中的种群增长符合逻辑斯蒂增长曲线,随亚硝酸钠质量浓度的增加,对盐蚕豆虫种群生长呈低浓度促进高浓度抑制的趋势。其中,高质量浓度组(77.00～154.00 mg·L-1)组亚硝酸钠胁迫盐蚕豆虫的最大种群密度和比生长率显著低于对照组,对盐蚕豆虫的种群生长产生了抑制作用。推断在一定浓度范围内亚硝酸盐可以作为机体的营养物质,但是超过阈值就会对水生生物产生抑制效果。陈强等[26]的研究也证实了水生动物对亚硝酸盐有一定的适应能力,但亚硝酸盐浓度过高会对水生生物造成免疫损伤。

亚硝酸盐作为水产养殖中常见的污染物,多数学者研究了亚硝酸盐对水生生物的毒性。韦永春等[27]研究发现红螯虾(Cheraxquadricariratus)对亚硝酸盐的安全浓度为2.2 mg·L-1;Huang等[28]发现南美白对虾(Litopenaeusvannamei)可以承受低于6.67 mg·L-1的亚硝酸盐;王煜恒等[29]研究发现正常溶氧条件下亚硝酸盐对中华绒螯蟹(Eriocheirsinenisis)的安全浓度为5.27 mg·L-1。本试验中,在低质量浓度组(9.63 mg·L-1)亚硝酸钠胁迫下盐蚕豆虫的最大种群密度显著高于对照组,促进盐蚕豆虫的种群生长。与上述水生生物对亚硝酸盐的耐受性相比,盐蚕豆虫对亚硝酸盐的耐受性较高,因此,纤毛虫具有维持和改善富营养化的水生生态系统的潜力,并可作为探究亚硝酸盐毒理学机制的模式生物。

3.2 亚硝酸钠对盐蚕豆虫抗氧化酶活性的影响

亚硝酸盐是自然水体中存在的一类物质,正常浓度范围内不会产生毒性。若有大量的亚硝酸盐沉积在养殖水体中,其会进入水生生物的血液和其他组织中,进而加速水生动物体内活性氧的形成,当生物系统中活性氧的浓度瞬时或长期增强时,导致细胞产生氧化损伤或死亡[30-31]。本试验中,盐蚕豆虫SOD、CAT、GPx和POD的活性均随亚硝酸盐处理时间和浓度的增加而显著变化,说明海洋类纤毛虫可通过抗氧化酶系统进行解毒。

SOD是一种重要的抗氧化酶,SOD催化超氧阴离子分解为过氧化氢,随后通过CAT或GPx降解为水和氧气[32]。在本研究中,当盐蚕豆虫暴露于亚硝酸钠时,SOD活性总体上呈先上升后下降的趋势。这与Ruan等[33]的研究基本一致,在苯酚胁迫下扇形游仆虫(Euplotesvannus)SOD活性也有类似变化。盐蚕豆虫SOD活性的增加表明亚硝酸钠胁迫会导致虫体活性氧的积累,为了应对体内的不利环境,SOD活性增加以去除体内多余的活性氧自由基,而高浓度的亚硝酸钠会影响盐蚕豆虫正常的代谢活动,对虫体造成损伤,导致SOD活性被抑制[34]。

CAT和GPx均是清除过氧化氢的抗氧化酶。本研究中,在12和24 h时亚硝酸钠各处理组CAT和GPx活性呈现先上升后下降的趋势,中浓度组(91.0和153.0 mg·L-1)盐蚕豆虫CAT和GPx活性增加,这与SOD活性变化的结果相印证。36 h时CAT活性变化不明显,GPx活性则被显著诱导,表明在胁迫初期,CAT和GPx一同作用于虫体内过氧化氢的清除,而胁迫后期GPx则成为盐蚕豆虫体内过氧化氢清除的主要作用酶。类似的CAT和GPx的协同作用关系,在其他研究中也有报道[35]。

POD能清除机体的过氧化物或氧化物,并且能够调节氧含量,使细胞免受高浓度氧毒害。本研究结果表明,在亚硝酸钠的胁迫下,盐蚕豆虫POD活性随亚硝酸钠浓度增加总体上呈升高趋势,高浓度组显著高于对照组,这与Hu等[36]研究尖吻鲈(Latescalcarifer)在亚硝酸盐胁迫后POD酶活性增加的变化趋势结果相似,亚硝酸盐胁迫会引起机体过氧化物反应,导致POD活性升高。

3.3 亚硝酸钠对盐蚕豆虫IBR的影响

由于水生生物的生物标志物响应与水生环境中的污染物暴露有关,使用各种生物标志物对水生生态系统中环境污染物的生态毒性评估引起了人们越来越浓厚的兴趣。然而单一生物标志物不能完全评价污染物对水生生物的毒性作用,因此使用IBR可以全面了解生物体如何对污染物暴露做出响应[37-38]。在本研究中,12 h时高浓度亚硝酸钠(153.0和235.8 mg·L-1)处理组IBR高于对照组,试验初期盐蚕豆虫在高浓度亚硝酸钠胁迫下产生了氧化应激,这与GPx和POD活性的变化趋势相似,并且可见抗氧化酶系统是较敏感的生物标志物。低浓度亚硝酸盐(91.0 mg·L-1)处理组IBR值在整个处理期间低于对照组,这与SOD、GPx和POD活性的变化趋势相印证,说明该浓度并未引起盐蚕豆虫的氧化应激作用,而盐蚕豆虫生长受到亚硝酸盐抑制的原因需要进一步探究。153.0和235.8 mg·L-1处理组IBR值在48 h明显升高,对盐蚕豆虫产生了毒性,盐蚕豆虫的抗氧化酶系统开始响应并逐渐升高以更好地保护机体不受到损害。因此,IBR指数可以大体反映盐蚕豆虫抗氧化酶活性的变化,但无法完全揭示亚硝酸盐对盐蚕豆种群生长的影响。