五味子甲素对去卵巢骨质疏松大鼠SDF-1/CXCR4信号通路的影响

朴海旺 金宝城 赵胜军

承德市中心医院骨二科,河北 承德 067000

骨是一种由有机基质矿化而不断形成的再生组织,成骨细胞和破骨细胞参与骨平衡的构建[1-2]。而破骨细胞和成骨细胞形成和功能的不平衡导致了许多骨疾病,如骨质疏松症[3]。骨质疏松症是一种与年龄相关的退行性疾病,可引起骨折[4]。五味子为临床常用中药,具有补肾养肺、生津止咳、保肝护肝、有助睡眠等功效[5]。五味子甲素是五味子的果实提取物,研究表明,五味子甲素能抑制Toll样受体4/核因子κB通路,降低溃疡性结肠炎大鼠炎症因子水平及肠道黏膜通透性,保护大鼠结肠组织[6]。五味子甲素同时也具备良好的抗肿瘤活性,能对肿瘤细胞的转移起到抑制作用,且五味子甲素能增强化疗敏感性,在协同抗癌药物治疗方面能增强抗癌药物的药效[7]。基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)/CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)通路与成骨分化有着密切的联系,有研究表明,SDF-1/CXCR4通路能够通过介导Janus激酶2/信号传导及转录激活因子3通路的激活,参与骨髓间充质干细胞的分化过程[8]。本课题组在前期研究发现五味子具有抗骨质疏松的效果,但这一效果是否是五味子甲素在发挥作用尚未可知。故本研究拟探讨五味子甲素对骨质疏松症大鼠的作用效果,并分析SDF-1/CXCR4通路在这一过程中的作用,以期为治疗骨质疏松症的新药研发提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1动物:SPF级别雌性SD大鼠,8～10周龄,体重242～268 g,购自江苏珂玛麒生物科技有限公司,生产许可证号:SCXK(苏)2021-0014,所有大鼠均饲养于室温为20～25 ℃,相对湿度为50 %～70 %的饲养房中,自由取食、饮水,自动光照/黑暗交替(12 h/12 h)。本研究经本院伦理委员会批准,审批号:基础LS2022(043)。

1.1.2药物与试剂:五味子甲素(批号MR39852,原料药,纯度≥98.8 %)、SDF-1/CXCR4通路抑制剂(AMD3100)(批号MF90184)购自湖南远泰生物技术有限公司;阿仑膦酸钠片(批号20210905)购自海南全星制药有限公司;Ⅰ型胶原交联羧基末端肽(CTX-Ⅰ)、骨钙素(OC)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒、HE染色试剂盒、BCA试剂盒、反转录试剂盒(批号分别为C23884、C39202、C20458、C59274、C10358)均购自青岛中仁澳兰生物工程有限公司;Trizol试剂、PCR试剂盒、蛋白裂解液、ECL发光液(批号分别为HAS0241、HAS3732、HAS1829、HAS5824)均购自深圳海思安生物技术有限公司;兔源SDF-1、CXCR4、GAPDH一抗、羊抗兔二抗(批号分别为SR00710、SR00529、SR10539、SR27481)均购自天津赛尔生物技术有限公司。

1.1.3仪器:双能X射线骨密度仪(型号Dexa Pro-II)、酶标仪(型号Synergy2)、显微镜(型号moticBA210)、荧光定量PCR仪(型号m2000rt)均购自上海然哲仪器设备有限公司;离心机(型号TD-4W)、凝胶成像系统(型号CBIO-UV6)均购自上海聚慕医疗器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1建模、分组及给药:采用去卵巢法构建骨质疏松症大鼠模型[9]:SD大鼠禁食不禁水12 h后,戊巴比妥钠麻醉,固定于手术台上,下腹部备皮,沿下腹部正中线切口,打开腹腔,结扎双侧卵巢动脉,切除双侧卵巢组织及周围少许脂肪组织,逐层缝合,消毒,抗生素预防感染。另取12只大鼠作为假手术组,手术过程中仅暴露卵巢不切除。手术12周后,采用双能X射线骨密度仪分别测定造模及假手术组大鼠左、右股骨骨密度(BMD),以造模大鼠左、右股骨BMD值低于假手术组且有统计学意义视为造模成功[10]。取造模成功的60只大鼠按照随机数表法分为模型组、五味子甲素低(20 mg/kg)、高(40 mg/kg)剂量组[11]、阿仑膦酸钠(1 mg/kg)组[12]、五味子甲素高剂量+AMD3100(40 mg/kg+5 mg/kg)组[13],每组12只。

分组完成后,五味子甲素低、高剂量大鼠分别给予20 mg/kg、40 mg/kg五味子甲素灌胃给药[11](将五味子甲素和生理盐水混溶成浓度分别为2 mg/mL、4 mg/mL的混悬液,灌胃体积10 mL/kg);阿仑膦酸钠组大鼠给予1 mg/kg阿仑膦酸钠灌胃给药[12](将阿仑膦酸钠片和生理盐水混溶成浓度为0.1 mg/mL的混悬液,灌胃体积10 mL/kg);五味子甲素高剂量+AMD3100组大鼠给予40 mg/kg五味子甲素灌胃,然后腹腔注射5 mg/kg的AMD3100[13];假手术组和模型组大鼠给予等体积生理盐水灌胃。各组给药每天1次,连续12周。

1.2.2大鼠左、右股骨BMD的测定:给药结束后,戊巴比妥钠麻醉大鼠,采用双能X射线骨密度仪分别测定各组大鼠左、右股骨BMD。

1.2.3大鼠血清中CTX-Ⅰ、OC水平的测定:BMD检测完成后,处死大鼠,心脏取血3 mL,分离大鼠双侧股骨组织,并分为两部分,一部分用4 %多聚甲醛固定,另一部分置于-80 ℃冰箱中保存。将收集的血液样品置于离心机中,4 ℃下5 800 r/min离心17 min,取上清,严格按照ELISA试剂盒说明书操作方法及步骤,检测上清液中CTX-Ⅰ、OC水平。

1.2.4大鼠股骨组织病理学变化:取1.2.3中固定于4 %多聚甲醛的大鼠股骨组织,脱钙,石蜡包埋,切片(5 μm),HE染色,显微镜下观察大鼠股骨组织病理学变化。

1.2.5大鼠股骨组织中SDF-1、CXCR4信使RNA(mRNA)水平的测定:取1.2.3中冻存大鼠股骨组织,加入液氮充分研磨,Trizol试剂提取股骨组织总RNA,反转录为cDNA,荧光定量PCR法检测大鼠股骨组织中SDF-1、CXCR4 mRNA水平,内参为GAPDH。引物由厦门仑昌硕生物科技有限公司设计合成,引物序列见表1。反应体系参照PCR试剂盒进行配置,SDF-1、CXCR4 mRNA水平使用2-△△Ct法计算。

表1 引物序列

1.2.6大鼠股骨组织中SDF-1、CXCR4蛋白水平的测定:取1.2.3中冻存大鼠股骨组织,加入液氮充分研磨,蛋白裂解液裂解,4 ℃下9 000 r/min离心14 min,BCA试剂盒定量总蛋白,取20 μg总蛋白,电泳分离后转膜,室温下脱脂牛奶(5 %)封闭1 h,然后与稀释好的兔源SDF-1(1∶530)、CXCR4(1∶820)、GAPDH(1∶950)一抗在4 ℃下过夜,加入羊抗兔二抗(1∶2 400),室温孵育1 h,ECL试剂显影,Image J软件分析蛋白条带灰度值,以GAPDH为内参,计算SDF-1、CXCR4蛋白水平。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 五味子甲素对骨质疏松症大鼠左、右股骨BMD的影响

与假手术组相比,模型组大鼠左、右股骨BMD显著降低(P<0.05);与模型组相比,五味子甲素低、高剂量组大鼠左、右股骨BMD依次升高(P<0.05);与五味子甲素高剂量组相比,阿仑膦酸钠组大鼠左、右股骨BMD差异无统计学意义(P>0.05),五味子甲素高剂量+AMD3100组大鼠左、右股骨BMD显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠左、右股骨BMD的比较

2.2 五味子甲素对骨质疏松症大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ水平的影响

与假手术组相比,模型组大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,五味子甲素低、高剂量组大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ水平依次升高(P<0.05);与五味子甲素高剂量组相比,阿仑膦酸钠组大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ水平差异无统计学意义(P>0.05),五味子甲素高剂量+AMD3100组大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ水平显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ水平的比较

2.3 五味子甲素对骨质疏松症大鼠股骨组织病理学变化的影响

假手术组大鼠股骨组织骨小梁结构正常,排列规则;模型组大鼠股骨组织骨小梁稀疏断裂,数量减少,排列紊乱;五味子甲素低、高剂量组大鼠股骨组织上述病理学变化程度依次减轻;阿仑膦酸钠组与五味子甲素高剂量组大鼠股骨组织病理学变化无显著差异;与五味子甲素高剂量组相比,五味子甲素高剂量+AMD3100组大鼠股骨组织病理损伤加重。见图1。

图1 各组大鼠股骨组织病理变化图(HE染色,200×)

2.4 五味子甲素对骨质疏松症大鼠股骨组织中SDF-1、CXCR4 mRNA水平的影响

与假手术组相比,模型组大鼠股骨组织中SDF-1、CXCR4 mRNA水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,五味子甲素低、高剂量组大鼠股骨组织中SDF-1、CXCR4 mRNA水平依次升高(P<0.05);与五味子甲素高剂量组相比,阿仑膦酸钠组大鼠股骨组织中SDF-1、CXCR4 mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05),五味子甲素高剂量+AMD3100组大鼠股骨组织中SDF-1、CXCR4 mRNA水平显著降低(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠股骨组织中SDF-1、CXCR4 mRNA水平的比较

2.5 五味子甲素对骨质疏松症大鼠股骨组织中SDF-1、CXCR4蛋白水平的影响

与假手术组相比,模型组大鼠股骨组织中SDF-1、CXCR4蛋白水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,五味子甲素低、高剂量组大鼠股骨组织中SDF-1、CXCR4蛋白水平依次升高(P<0.05);与五味子甲素高剂量组相比,阿仑膦酸钠组大鼠股骨组织中SDF-1、CXCR4蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05),五味子甲素高剂量+AMD3100组大鼠股骨组织中SDF-1、CXCR4蛋白水平显著降低(P<0.05)。见图2、表5。

注:A:假手术组;B:模型组;C:五味子甲素低剂量组;D:五味子甲素高剂量组;E:阿仑膦酸钠组;F:五味子甲素高剂量+AMD3100组。

表5 各组大鼠股骨组织中SDF-1、CXCR4蛋白水平的比较

3 讨论

骨质疏松症的特点是骨强度低,骨折风险高,骨折的发生也能导致严重临床后果,包括疼痛、残疾、丧失独立性甚至死亡[14]。通常情况下,骨质疏松症通过测量BMD进行诊断,某些情况下,也可以通过脆性骨折或独立于BMD的高骨折概率来诊断[15]。但骨质疏松症的治疗较为复杂,通常情况下需要健康的生活方式和良好的营养,预防跌倒,以及避免暴露于骨骼毒素和药物治疗[16]。CTX-Ⅰ是骨吸收过程中的产物,血液中CTX-Ⅰ的水平能反映骨吸收过程,同时也能反映骨细胞的活动情况。OC是一种非胶原蛋白,其水平变化能反映骨代谢的变化[17]。在骨质疏松症中,CTX-Ⅰ和OC水平的下降代表了骨代谢的失衡[18]。本研究通过去卵巢法构建骨质疏松症大鼠模型,结果显示造模成功的大鼠左、右股骨BMD、血清中OC、CTX-Ⅰ水平显著降低,病理学结果显示,假手术组大鼠股骨组织骨小梁结构正常,排列规则;模型组大鼠股骨组织骨小梁稀疏断裂,数量减少,排列紊乱。表明骨质疏松症大鼠模型构建成功,股骨组织发生病变。

五味子甲素是五味子的主要活性成分,有抗炎、抗癌、抗病毒等作用[19]。耿峰等[20]研究表明,五味子甲素能显著降低腹泻型肠易激综合征大鼠结肠组织中炎症因子水平,改善大鼠肠上皮黏膜屏障功能。五味子的药效广泛,具有促进成骨细胞分化,维持骨平衡等作用,同时对于调控破骨细胞和保护软骨组织方面均具有一定效果[21]。既往有研究显示,五味子提取物可以改善骨质疏松大鼠的骨强度和骨代谢,其机制是抑制破骨细胞骨吸收和增加成骨细胞分化的活性[22]。本研究使用五味子甲素处理骨质疏松症大鼠以探究五味子甲素在骨质疏松症中的作用,结果显示,五味子甲素处理后的骨质疏松症大鼠股骨组织病变程度减轻,大鼠左、右股骨BMD、血清中OC、CTX-Ⅰ水平升高,且五味子甲素剂量越高,改善效果越好。表明五味子甲素能抑制骨质疏松症大鼠BMD的下降,改善大鼠骨质疏松,结合姜南希等[21]的研究,猜测这可能与五味子甲素能维持骨平衡有关。

SDF-1/CXCR4信号通路参与多种器官病理生理过程,还与细胞分化等过程密切相关[23]。石新慧等[24]研究表明,瑞芬太尼能通过抑制SDF-1/CXCR4信号通路,减轻气腹大鼠肾损伤。Wang等[25]报道,柚皮素可促进SDF-1/CXCR4信号通路活化,从而增强骨髓间充质干细胞成骨分化。SDF-1/CXCR4通路在骨质疏松的发生发展中也起重要作用,鄂远等[26]研究发现,补肾活血汤能通过激活SDF-1/CXCR4通路,加速骨质疏松骨折大鼠的骨折愈合,促进骨形成。本研究发现,骨质疏松症大鼠股骨组织中SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白水平显著低于健康大鼠;经五味子甲素处理后,骨质疏松症大鼠股骨组织中SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白水平显著升高,且呈现剂量依赖性。在高剂量五味子甲素的基础上给予AMD3100干预后发现,AMD3100可逆转高剂量五味子甲素对骨质疏松症大鼠上述指标的改善效果。结合Wang等[25]和鄂远等[26]研究结果,本研究认为五味子甲素对骨质疏松症大鼠的治疗作用,其机制可能与激活SDF-1/CXCR4信号通路有关,SDF-1/CXCR4通路表达增强会促进骨髓间充质干细胞成骨分化,改善骨质疏松症状。

综上所述,五味子甲素能抑制骨质疏松症大鼠BMD的下降,减轻大鼠股骨组织病变,改善大鼠骨质疏松,这一机制可能通过激活SDF-1/CXCR4信号通路来实现。但本研究仅探究了五味子甲素通过SDF-1/CXCR4信号通路对骨质疏松症大鼠的保护作用,五味子甲素能否通过其他通路发挥对骨质疏松症大鼠的治疗作用,有待深入研究。