新型右旋糖酐铁注射剂对哺乳仔猪生长性能、免疫性能及铁代谢的影响

2023-10-16杜雯婷罗玉衡

动物营养学报 2023年9期

杜雯婷余冰何军郑萍阎辉罗玉衡虞洁

(四川农业大学动物营养研究所,动物抗病营养教育部重点实验室,成都 611130)

铁是哺乳期仔猪生长发育必需的微量元素之一,是合成血红蛋白及肌红蛋白、转运营养成分、提高机体免疫功能、促进仔猪生长的重要物质[1-2]。哺乳期仔猪因生长迅速,铁贮备和乳汁铁摄入不足,常会出现铁缺乏现象,易导致仔猪出现免疫功能受损、发育迟缓及缺铁性贫血等问题[3-4]。

针对哺乳期仔猪铁缺乏现象,生产上通常会在仔猪1～3日龄时肌肉注射补铁剂,以达到有效预防仔猪缺铁性贫血,促进仔猪生长发育的目的[5]。右旋糖酐铁因其对胃肠道刺激小、毒副作用小、性质稳定等优点常被用作仔猪补铁注射剂的主要成分[6]。然而右旋糖酐铁注射剂常会因为制造工艺差异等原因出现右旋糖酐铁分子质量不稳定、重金属以及蛋白质等杂质含量过高的情况,从而导致仔猪出现注射皮下出现淤青、过敏、铁吸收不佳、哺乳后期贫血等不良反应[7-8]。因此,改进右旋糖酐铁注射剂的制造工艺可以避免注射补铁剂给仔猪带来的不良影响,更好地促进仔猪生长发育,提高仔猪免疫性能。

目前有一种新制造工艺的右旋糖酐铁注射剂,其通过将纯化的右旋糖酐碱化后形成碱化右旋糖酐,同时利用微乳化络合技术将氯化铁(FeCl3)及维生素A、维生素D、维生素E和碱化右旋糖酐结合,并通过微孔滤膜技术去除高分子右旋糖酐铁及杂质,形成注射用右旋糖酐铁络合物。但该新型右旋糖酐铁注射剂对哺乳期仔猪的实际应用效果还有待于系统评估。

因此,本研究选择新型右旋糖酐铁注射剂和传统工艺制造的普通右旋糖酐铁注射剂,旨在比较分析新型右旋糖酐铁对哺乳仔猪生长性能、免疫性能以及铁代谢的影响,为哺乳仔猪注射补铁剂提供更好的方案。

1 材料与方法

1.1 试验材料

普通右旋糖酐铁注射剂含铁量为10%,由广西某研究所兽药厂生产;新型右旋糖酐铁注射剂含铁量为10%,由四川某动科药业有限公司提供。

1.2 试验设计

试验采用单因子试验设计,选择18窝3日龄、平均体重[(1.77±0.53) kg]相近的健康杜长大哺乳仔猪,随机分为3组,每组6个重复,每个重复1窝(12头)仔猪。对照组仔猪不注射补铁剂,普通右旋糖酐铁组每头仔猪注射2 mL普通右旋糖酐铁注射剂,新型右旋糖酐铁组每头仔猪注射2 mL新型右旋糖酐铁注射剂。试验期21 d。

1.3 饲养管理

试验前圈舍严格消毒、通风、干燥。母猪于妊娠期110 d转入产房待产,产后24 h内根据母猪有效乳头数调整每头母猪带仔数,保证每窝仔猪平均体重接近。泌乳期母猪保证泌乳期适宜的光照,保持圈舍通风干燥、清洁。每天观察仔猪健康状况、精神状态及腹泻情况。

1.4 样品采集及处理

1.4.1 血液样本

仔猪21日龄时,每窝选取1头仔猪前腔静脉采血20 mL,分装于促凝管和抗凝管中。促凝管中血液静置30 min后3 500 r/min离心15 min,吸取上层血清,分装保存于-20 ℃待测。抗凝管血液采集4 h内送检。

1.4.2 肝脏、脾脏样本

每个重复选取1头接近平均体重的仔猪,共18头仔猪采血后屠宰,快速取仔猪肝脏以及脾脏各10 g左右 (保持各猪同一组织取样部位一致),剪碎后分装于无菌冻存管中,立即液氮速冻后-80 ℃保存。

1.5 指标测定

1.5.1 生长性能

在整个动物试验期间对仔猪的健康状况进行观察和记录。在试验开始当天和试验第21天对18窝仔猪进行称重,试验第21天即为仔猪断奶日,记录初始重、断奶重。计算仔猪平均日增重(ADG)、断奶存活率(断奶仔猪存活数/初生仔猪数)。

1.5.2 皮毛评分

于试验开始当天、试验第7、14、21天从每窝仔猪中随机选择4头猪进行皮毛感观打分(表1)。

皮毛得分=皮肤红润程度得分+毛色亮度
得分+毛凌乱程度得分。

表1 皮毛打分标准

1.5.3 血清铁、肝脏铁、脾脏铁含量及血清转铁蛋白含量

采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定仔猪血清铁含量及肝脏、脾脏铁含量。采用江苏酶免实业有限公司试剂盒测定血清转铁蛋白含量。

1.5.4 血常规和血清生化指标

将加入抗凝剂的血液在4 h内测定血常规参数,包括白细胞数、红细胞数、血红蛋白含量、血小板数。血常规送至雅安市人民医院测定。

采用全自动生化分析仪测定血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、尿素氮(UN)含量及谷草转氨酶(ALT)活性。采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。

1.5.5 血清免疫指标

采用江苏酶免实业有限公司试剂盒测定血清白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)的含量及血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)的含量。

1.5.6 基因表达

采用实时荧光定量PCR测定肝脏铁调素(Hepcidin)基因相对表达量。总RNA的提取按照试剂盒(Trizol Reagent,TaKaPa,日本)操作说明进行,cDNA的合成使用逆转录试剂盒(Prime ScriptTMregent kit,TaKaPa,日本)。引物序列由上海生工生物工程公司合成,引物序列见表2。实时荧光定量PCR反应体系为10 μL:5 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×),0.5 μL上游引物,0.5 μL下游引物,3 μL双蒸水,1 μL cDNA模板。以β-肌动蛋白(β-action)为内参基因,使用2-△△Ct方法计算目的基因的相对表达量。

1.6 数据处理

试验数据使用Excel 2016进行初步计算处理与整理,采用SPSS 21.0软件的one-way ANOVA程序进行单因素方差分析,并用Duncan氏法比较组间差异,结果均以“平均值±标准误”表示。P<0.05表示差异显著,0.05≤P<0.10表示差异具有显著性趋势。

2 结果与分析

2.1 新型右旋糖酐铁注射剂对哺乳仔猪生长性能的影响

由表3可知,与对照组相比,普通和新型右旋糖酐铁均可以显著提高仔猪的平均日增重(P<0.05);新型右旋糖酐铁组仔猪断奶重提高15.5%,普通右旋糖酐铁组仔猪断奶重提高10.2%,但均未达到显著水平(P>0.05),各组间仔猪断奶存活率没有显著差异(P>0.05)。

2.2 新型右旋糖酐铁注射剂对哺乳仔猪皮毛评分的影响

由表4可知,试验第1天,3组之间皮毛评分没有显著差异(P>0.05),试验第7和14天时,新型右旋糖酐铁组仔猪皮毛评分显著高于普通右旋糖酐铁组和对照组(P<0.05),试验第21天时,新型右旋糖酐铁组仔猪皮毛评分显著高于对照组(P<0.05)。

2.3 新型右旋糖酐铁注射剂对哺乳仔猪血常规的影响

由表5可知,与对照组相比,新型右旋糖酐铁组仔猪血液白细胞数、红细胞数、血红蛋白含量显著升高(P<0.05),血小板数显著降低(P<0.05)。

2.4 新型右旋糖酐铁注射剂对哺乳仔猪血清生化指标的影响

由表6可知,与对照组相比,新型右旋糖酐铁组仔猪血清中UN的含量显著降低(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05)。新型右旋糖酐铁组仔猪血清ALB含量显著高于普通右旋糖酐铁组和对照组(P<0.05)。3组血清AST、SOD活性及GLB、TP含量无显著差异(P>0.05)。

2.5 新型右旋糖酐铁注射剂对哺乳仔猪血清免疫指标的影响

由表7可知,与对照组和普通右旋糖酐铁组相比,新型右旋糖酐铁组仔猪血清IL-1β、IL-6的含量显著降低(P<0.05),IgA含量显著提高(P<0.05);与对照组相比,新型右旋糖酐铁组仔猪血清IgG含量增加(P<0.05),血清IFN-γ含量显著增加(P<0.05)。3组血清IgM、IL-10、TNF-α含量无显著差异(P>0.05)。

表3 新型右旋糖酐铁注射剂对哺乳仔猪生长性能的影响

表4 新型右旋糖酐铁注射剂对哺乳仔猪皮毛评分的影响

表6 新型右旋糖酐铁注射剂对哺乳仔猪血清生化指标的影响

表7 新型右旋糖酐铁注射剂对哺乳仔猪血清免疫指标的影响

2.6 新型右旋糖酐铁注射剂对哺乳仔猪铁及转铁蛋白含量的影响

由表8可知,与对照组相比,新型右旋糖酐铁组仔猪血清转铁蛋白、血清铁及肝脏铁含量显著增加(P<0.05),脾脏铁含量无显著差异(P>0.05)。

2.7 新型右旋糖酐铁注射剂对哺乳仔猪肝脏Hepcidin基因相对表达量的影响

由表9可知,与对照组相比,新型右旋糖酐铁组仔猪肝脏Hepcidin基因相对表达量显著上调(P<0.05)。

表9 新型右旋糖酐铁注射剂对哺乳仔猪肝脏Hepcidin基因相对表达量的影响

3 讨论

3.1 新型右旋糖酐铁注射剂对哺乳仔猪生长性能、皮毛评分的影响

铁是构成机体血红蛋白、肌红蛋白及某些酶类的基本元素,具有重要的生理功能,是维持动物机体正常生长发育的必需微量元素之一[9]。刚出生的仔猪体内铁贮备量极少,仅含有约50 mg铁,仅能满足仔猪出生3～7 d的铁需要量;而母猪乳汁的铁含量也极低,仅有1 mg/L的铁[10]。仔猪生长速度也较其他同体型的动物更快,其在6周龄时体重就为出生重的7～8倍,因此其对铁的需要量也更大[11]。这些因素使得哺乳期仔猪需要在出生后3～4 d额外补充铁来维持机体的正常生长发育。针对哺乳期仔猪铁缺乏现象,目前生产上通常会对仔猪进行肌肉注射补铁剂补铁。右旋糖酐铁因溶解性好、吸收性好等优势常会被当作注射补铁剂应用在养猪生产中[4]。杨涛等[12]给2日龄的藏猪肌肉注射1 mL右旋糖酐铁,发现补铁的仔猪断奶重显著高于未补铁仔猪,且腹泻数、发病率、死亡数等指标均低于未补铁仔猪。张学成等[13]在仔猪3日龄时对仔猪进行肌肉注射右旋糖酐铁,发现注射右旋糖酐铁的仔猪断奶重较未补铁仔猪提高13.4%。Chen等[14]试验发现,注射右旋糖酐铁的仔猪比未添加铁的对照组仔猪生长更快,断奶重也显著提高。本试验研究结果基本与前人一致。与对照组相比,注射新型右旋糖酐铁的仔猪平均日增重显著提高,比注射普通右旋糖酐铁仔猪平均日增重提高幅度更大。对比未补铁仔猪,新型右旋糖酐铁组仔猪断奶重提高了15.5%,优于普通右旋糖酐铁组。这一结果证明了新型右旋糖酐铁注射剂可更有效地提高哺乳期仔猪的生长性能,为仔猪断奶后期的生长发育打下了良好基础。

仔猪皮肤的红润程度、毛色亮度及毛凌乱程度可以反映仔猪的健康状况。当仔猪出现缺铁现象时,会出现精神萎靡、皮肤苍白、被毛粗乱无光泽等现象[15]。王继萍等[16]试验发现,与未补铁仔猪相比,饲粮添加3种有机铁均可显著提高仔猪皮毛指数。杨敏等[17]试验也证实仔猪补充有机铁可有效改善仔猪皮毛指数。程素芳等[18]对母猪注射补铁剂进行补铁,试验发现与未注射补铁剂的母猪及新生仔猪相比,注射补铁剂的母猪及新生仔猪皮毛指数显著提高。本试验结果与前人研究结果一致,与未补铁仔猪相比,注射新型右旋糖酐铁的仔猪皮毛指数显著提高,可在哺乳仔猪生长阶段有效改善皮毛指数。

3.2 新型右旋糖酐铁注射剂对哺乳仔猪血常规、血清生化指标的影响

血红蛋白含量可用于检测仔猪体内铁的储备状态,仔猪体内的血红蛋白含量在100 g/L以上时证明仔猪体内铁贮备情况好,低于80 g/L时仔猪会出现贫血症状,低于60 g/L时表明仔猪已经严重贫血[19]。仔猪红细胞正常数量是(5.51±0.36)×1012个/L,在非病理情况下,仔猪机体的红细胞数和白细胞数因为贫血而显著降低[20]。机体铁缺乏会刺激骨髓干细胞向巨核细胞转化,随着巨核细胞的生成增多和清除减少,血小板数会随着生成增多,随着清除减少[21]。Evstatiev等[22]试验也发现,与正常大鼠相比,缺铁大鼠血小板计数和血小板体积显著增加。本试验发现,对照组血液红细胞数和白细胞数降低而血小板数大幅升高。该结果与前人的研究结果一致,表明铁缺乏导致血红蛋白合成障碍,引起血容量降低,从而导致继发的血小板数升高,及时给新生仔猪注射铁制剂可以逆转血细胞数量的异常。

李伟[23]试验发现,仔猪补充有机铁对比未补铁仔猪可显著提高血红蛋白含量,同时可有效提高仔猪白细胞数和红细胞数。董正林[24]研究发现,仔猪3日龄时肌肉注射右旋糖酐铁可显著升高仔猪血红蛋白含量。Tyler等[25]试验表明,哺乳仔猪缺铁会导致血红蛋白含量下降,注射右旋糖酐铁后可显著提高仔猪血红蛋白含量。Zhao等[26]试验发现,与未注射补铁剂相比,注射右旋糖酐铁的仔猪白细胞数、红细胞数和血红蛋白含量提高。本试验中,对照组血红蛋白含量已经低于60 g/L,表明对照组因缺铁已出现贫血症状,注射新型右旋糖酐铁处理的仔猪血红蛋白含量大于100 g/L,证明在经过注射补铁剂后仔猪体内铁贮备情况有显著提升。与对照组相比,经过补铁的2个组血液白细胞数、红细胞数均显著增加,这也证明了通过注射右旋糖酐铁可有效缓解仔猪缺铁状况。

血清生化指标可以直接反映动物机体的健康状态与动物体内营养物质的沉积情况,有助于评估动物的总体健康和生长状况。血清AST活性可以反映机体肝脏、心脏等组织的损伤情况,其活性的升高可能表示机体肝脏、心脏等组织受损[27]。血清中ALB和GLB含量可以反映动物机体蛋白质吸收代谢状况以及免疫水平[28]。血清ALB含量的升高可能有助于蛋白质在机体组织中的沉积,血清GLB含量会在机体发生急性应激或组织损伤等情况下升高[27]。UN作为蛋白质和氨基酸的终产物,其在血清中的含量能反映机体对蛋白质的吸收效率,其在血清中含量越低,说明机体对蛋白质的吸收效率越好[29]。李妍[27]研究发现,与基础饲粮不添加铁源组相比,添加铁剂的仔猪血清ALB含量显著提高,GLB含量没有显著变化,血清UN含量显著下降。王静静[30]研究发现,与未补铁仔猪相比,补铁可以增加血清TP和ALB含量。本试验中新型右旋糖酐铁组仔猪血清AST活性与对照组及普通右旋糖酐铁组差异不显著,这说明新型右旋糖酐铁注射剂并未对心脏和肝脏带来不良反应。注射新型右旋糖酐铁组仔猪血清ALB含量显著高于普通右旋糖酐铁组和对照组,同时与对照组相比血清UN含量显著下降,这些指标能反映新型右旋糖酐铁可以更有效地提高仔猪机体蛋白质的合成与吸收。

MDA是氧自由基攻击多不饱和脂肪酸产生的一种具有很强生物毒性的脂质过氧化物,其含量可以反映肝脏组织内脂质过氧化情况。韩迦南[31]试验发现,仔猪补充过量铁会导致仔猪血清MDA含量升高,血清SOD活性显著降低,引起肝脏组织损伤。从本试验结果可以看到,新型右旋糖酐铁组的仔猪血清MDA含量显著低于对照组,SOD活性与对照组相比差异显著,说明新型右旋糖酐铁不会引起肝脏组织损伤,反而能够减少机体脂质过氧化物,维持仔猪机体的动态平衡。

3.3 新型右旋糖酐铁注射剂对哺乳仔猪免疫性能的影响

免疫系统由免疫组织、器官、免疫细胞及免疫活性分子等组成。免疫球蛋白属于免疫活性分子的一种,其中IgA可清除呼吸道、消化道等黏膜上皮的病原体;IgG是机体血清中含量最高的免疫球蛋白,具有中和毒素的抗菌抗病毒作用,在体液免疫中最为重要;IgM能跟补体结合起到溶解病原体的效果[32-33]。仔猪机体如果缺铁将会导致免疫性能的降低,增加患病的风险。杨敏[17]试验发现,猪补充有机铁可显著提高血清IgA、IgG含量。陈凤芹等[32]试验发现,有机铁可提高仔猪血清IgG含量。李梁梁等[34]试验也证实,补充有机铁可以有效提高仔猪血清IgA、IgG、IgM含量。本试验研究发现,与对照组和普通右旋糖酐铁组相比,新型右旋糖酐铁组仔猪血清IgA和IgG含量显著提高,能有效提高仔猪的免疫性能。

白细胞介素是一种免疫细胞因子,其中IL-1β、IL-6是机体促炎细胞因子,IL-10则是机体抗炎细胞因子。TNF-α是一种可以调节免疫反应,影响转铁蛋白和铁蛋白表达,从而影响机体铁代谢的细胞因子。IFN-γ由Th1细胞分泌,对造血系统具有促进作用,可正向调控造血系统[35]。杨玉湘等[36]试验发现,缺铁性贫血的儿童补充右旋糖酐铁后血清IL-6含量显著降低,IFN-γ含量显著增加。Song等[37]的研究表明,加铁剂的小鼠的血清IL-1β、TNF-α、IL-6含量显著低于缺铁性贫血的小鼠。本试验中,新型右旋糖酐铁组的仔猪血清IL-1β、IL-6含量显著降低,同时IFN-γ含量显著提高。

从本试验可知,新型右旋糖酐铁可提高仔猪血清免疫球蛋白含量和影响免疫细胞因子的变化,达到提高仔猪免疫性能的目的。新型右旋糖酐铁对仔猪免疫性能的提高可能是由于其添加了维生素A、维生素D、维生素E,这将更有助于机体免疫细胞的增殖与生长,可提高机体免疫力。

3.4 新型右旋糖酐铁注射剂对哺乳仔猪铁代谢的影响

血清铁含量是可以很好地反映体内铁贮备的特异性指标,也是评价仔猪铁状况的主要指标,与肝脏铁含量存在显著相关。转铁蛋白多由肝脏细胞产生合成,主要生理功能是同机体铁结合转送至机体细胞内,是维持铁代谢稳定的重要蛋白质[38]。李梁梁等[34]研究发现,猪补充有机铁可增加血清铁、血清转铁蛋白含量。周文俊[39]试验发现,与未补铁仔猪相比,补充有机铁的仔猪血清铁、肝脏铁含量显著提高。本试验结果与前人研究结果一致,发现仔猪注射右旋糖酐铁可显著提高血清铁和肝脏铁、转铁蛋白含量,证明新型右旋糖酐铁注射剂可有效改善仔猪机体铁水平,促进机体铁代谢。

Hepcidin是主要由肝脏合成和分泌的一种多肽,在机体铁代谢中发挥着重要作用[40]。Hepcidin可通过抑制小肠铁吸收及单核巨噬细胞系统铁释放来调节机体对铁的吸收利用,达到维持机体铁平衡的目的[41]。Staroń等[42]试验发现,注射右旋糖酐铁的仔猪肝脏Hepcidin基因表达量与未注射补铁剂仔猪相比显著上调。蒲雨田[43]研究发现,注射右旋糖酐铁试剂的仔猪对比没有注射补铁剂的仔猪肝脏Hepcidin基因相对表达量显著上调。本试验结果与前人研究结果一致,注射右旋糖酐铁可显著上调肝脏Hepcidin基因相对表达量,更好地参与机体铁代谢,维持机体铁平衡。