温阳复元方联合miR-137模拟剂调控线粒体铁死亡对脑缺血再灌注损伤大鼠的作用机制

李丽琴,张 鼎,袁 莉,向军军,陈 炜,胡跃强

(1.广西中医药大学,广西 南宁 530001;2.广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530001)

缺血性中风(Ischemic stroke,IS)作为临床常见的一种因大脑血流中断或受阻,从而引发的以神经功能缺损为主要表现的脑血管疾病[1-2]。本病的发病机制较为复杂,近年来,线粒体铁死亡(Ferroptosis,FPT)俨然成为了缺血性中风疾病的研究新热点。线粒体铁死亡是一种受铁调控的非凋亡细胞死亡形式,其发展过程以脂质活性氧物质在神经细胞的大量堆积,最终导致氧化应激发生以及神经元凋亡[3-4]。因此,靶向调控线粒体铁死亡通路相关蛋白可能为治疗缺血性中风提供一种全新的策略。

近年来,miRNA作为一种存在于各种疾病病理过程的调节剂,逐渐映入学者眼帘[5]。多项研究显示,miR-137可通过谷氨酸转运体-1(GLT-1)负性调节细胞铁稳态[6],但其能否通过调控铁代谢相关蛋白,从而发挥神经保护作用尚不明确。此外,大量事实证据表明,中医学可以间接性地调控相关小分子,从而靶向通路蛋白和mRNA的上调或下调,而以“阳虚为本”的温阳复元方正是基于这一特性。故本研究以miR-137为立足点,通过联合温阳复元方,进而调控铁通路相关蛋白的表达,从而为本方的基础研究提供客观科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SPF级SD老龄大鼠75只,12月龄,体重250～300 g,由广西中医药大学第一附属医院动物实验中心提供,生产许可证号:SCXK(湘)2019-0014。本实验方案通过广西中医药大学动物伦理委员会批准(批号:DW20211204-195)。

1.2 实验药物 温阳复元方组成:白附片、黄芪、党参各30 g,石菖蒲20 g,淫羊藿、田三七各15 g,干姜10 g,炙甘草6 g。以上药物均由广西中医药大学第一附属医院药剂科统一采购,要求同一批次(批号:20190701)、同一质量、同一产地。所有药物浸泡30 min,白附片先煎1 h,后加入其他药物,分两次煎煮;再大火浓缩至含原生药浓度1.0 g/ml的药液。根据成人(70 kg)与大鼠体表面积换算,确定大鼠灌胃剂量为14.04 g/kg。

1.3 主要试剂和仪器

1.3.1 实验试剂:miR-137模拟腺相关病毒(上海吉满生物科技有限公司),Trizol Reagent(美国Ambion公司,批号:284909),逆转录试剂盒(上海新贝生物科技有限公司):mRNA逆转录试剂盒(批号:F2967),miR-137逆转录试剂盒(货号:F3528);扩增试剂盒(上海新贝生物科技有限公司):mRNA扩增试剂盒(批号:F2967),miR-137扩增试剂盒(货号:F3528);一抗(北京Affinity Biosciences公司):TFR(货号AF5343,1∶2000);BCRP(货号 AF5177,1∶2000);二抗:山羊抗兔HRP-IgG(北京Biosharp公司,货号 BL003A,1∶20000);ECL化学发光物测试盒,DEPC水,Marker,GAPDH抗体(北京Biosharp公司,货号分别是:BL523A,BL510A,BL712A,BL0068)。

1.3.2 实验仪器:Stero Drive立体定位系统;多功能酶标仪(M200PRO型/瑞士TECAN公司); PCR仪(Light Cycler 96型/瑞士Roche公司);光学显微镜(Olympus型/CX41-12 C02)低温离心机(Centrifuge 5418型/德国Eppendorf公司);电泳仪(Power Pac Basic型/美国BIO-RAD公司);凝胶成像系统(Chemi Doc XRS型/美国BIO-RAD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠分组及处理:75只SD大鼠分为五组,分别是假手术组、模型组、温阳复元方组、miR-137模拟组以及miR-137模拟对照组(n=15),每组按照再灌注时间点24 h、7 d、14 d分为三个亚组(n=5)。在Longa线栓法[10]的基础上加以改良制备大鼠脑右侧CIRI模型,正常的大鼠脑组织呈现为红色,而I/R损伤的大鼠脑组织呈现为白色,为明显的脑梗死,证明I/R损伤大鼠模型制作成功(图1)。各组分别作如下处理。假手术组:仅暴露大鼠右侧大脑颈动脉并缝合。模型组:线栓插入大鼠颈内动脉17 mm并结扎,2 h后拔出线栓造成I/R,造模后正常饲养;温阳复元方组:在制作I/R模型前30 min给予温阳复元方灌胃,待大鼠麻醉清醒2 h后,每天上、下午各1次继续予该方灌胃。miR-137模拟组和miR-137模拟对照组:颅内缺血侧大脑中动脉(MCA)区分别注射miR-137 模拟剂及miR-137空载体,注射7 d后制备I/R模型,余步骤同温阳复元方组。

图1 成模后大鼠TTC染色(24 h)

1.4.2 脑立体定位注射相关病毒:使用0.3%戊巴比妥钠以10 ml/kg的剂量麻醉大鼠后,将其固定在脑立体定位仪框架中,参照大鼠脑立体定位图谱,将注射器移至大脑MCA附近并标记(以前囟点为0点,向后3.5 mm,向右2.5 mm),用颅骨钻在标记点垂直钻一小孔,将注射器自颅骨表面垂直进针3 mm,分别将腺相关病毒miR-137 mimic和miR-137空载体以0.4 μl/min的速度缓慢注射到miR-137模拟组和miR-137模拟对照组的大鼠脑内,注射完成后留针5 min,将微量注射器缓慢拔出。

1.4.3 神经功能缺损评分:采用Zea-Longa 5级评分法[7]对清醒后的大鼠进行神经功能评分。1级(0分):大鼠无神经功能缺损;2级(1分):大鼠无法充分伸展左爪,为轻度神经功能损伤;3级(2分):大鼠向左侧转圈,为中度神经功能损伤;4级(3分):大鼠不断向左侧倾斜,为重度神经功能损伤;5级(4分):大鼠已基本无意识。剔除4分大鼠,选择造模成功的大鼠进入实验。

1.4.4 TTC染色:造模结束后,选取模型组大鼠进行麻醉后直接断头取脑,应当保持大脑的完整性,-20 ℃冷冻20 min后进行切片,然后切成2 mm厚的冠状切片(5～6片),将切片置于浓度为2%氯化三苯四氮唑(TTC)中,在37 ℃下孵育30 min,将每段在4%多聚甲醛中浸泡24 h,然后拍照,观察脑梗死病变。

1.4.5 RT-qPCR 检测缺血侧相关因子mRNA的表达:使用 Trizol试剂提取大鼠总RNA。提取后,测定RNA 的浓度和纯度,使用mRNA逆转录试剂盒在37 ℃下15 min和 85 ℃下5 s进行逆转录,得到在RNA各个位置逆转录效率均一的cDNA,最后进行扩增,过程如下:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性10 s,60 ℃退火30 s,使用全自动实时荧光定量仪器进行 PCR 产物的检测。所用引物序列见表1。实验所得数据采用2-ΔΔCt法计算分析。

表1 基因扩增引物信息

1.4.6 Western blot检测缺血侧相关因子蛋白表达:从-80 ℃冰箱取出保存的大鼠脑组织,剪下适量,放进配制好的细胞裂解液(PMSF:高效RIPA组织细胞裂解液)中,各试管总量加500～600 μl,使用高速低温组织研磨机研磨均匀,后在离心机中4 ℃,12000 r/min离心10 min,取上清液,加入5倍蛋白质上样缓冲液,然后高温水煮6～8 min,变性、置冷,-20 ℃保存,根据目的蛋白分子量大小配制10%的分离胶和5%的浓缩胶,将准备好的样品上样,恒压80 V,电泳结束后,将 PAGE胶从玻板上卸下,转膜,在湿式转印槽中恒流200 mA转1 h,将蛋白转移到PVDF膜上,取1 g 5%脱脂奶粉加进4 ml的PBST溶液中配成封闭液备用,将膜与一抗在4 ℃下封闭孵育过夜;用PBST洗膜3次,每次10 min;用二抗液稀释二抗,室温下孵育二抗1 h。用1×PBST洗膜3次,每次10 min;按1∶1比例混合ECL化学发光物测试盒中的A液和B液用以显示条带,进行图像采集,图像处理软件(Image J)用于图像分析蛋白相对表达水平。

1.5 统计学方法 采用SPSS 25.0统计学软件进行分析。计量资料使用均数±标准差表示,多个样本间的比较采用单因素方差分析,组间比较方差齐者,则用LSD-t检验,方差不齐者,则用非参数检验(Tamhane’sT2检验);P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 见表2。假手术组大鼠无神经功能损伤症状;与假手术组相比,模型组大鼠有明显的神经功能损伤,神经功能评分显著升高(P<0.01);与模型组比较,其余各组神经功能评分明显降低(P<0.01,P<0.05),且miR-137模拟组得分最低。

表2 各组大鼠神经功能缺损评分比较(分)

2.2 各组大鼠脑组织miR-137表达量比较 见表3。与假手术组相比,模型组miR-137的mRNA表达显著降低(P<0.01)。与模型组相比,温阳复元方组和miR-137模拟组中miR-137的表达量明显升高(P<0.01),以miR-137模拟组最为显著;与miR-137模拟对照组相比,miR-137模拟组其表达明显升高(P<0.01),于7 d时达最高峰(P<0.01)。

表3 各组大鼠miR-137表达量比较

2.3 各组大鼠脑组织TFR、BCRP mRNA的表达比较 见表4。与假手术组相比,模型组TFR mRNA表达量明显升高(P<0.01),BCRP mRNA表达量在各时间点均显著降低(P<0.01);与模型组比较,温阳复元方组和miR-137模拟组中TFR mRNA表达量显著降低,BCRP mRNA表达量明显升高(P<0.01),以miR-137模拟组最为显著;与miR-137模拟对照组相比,miR-137模拟组TFR mRNA表达量明显降低,BCRP mRNA表达量明显升高(P<0.01),于7 d表达量最为显著。

表4 各组大鼠脑组织TFR、BCRP mRNA表达比较

2.4 各组大鼠脑组织TFR、BCRP蛋白相对表达量比较 见表5(图2)。与假手术组相比,模型组TFR 蛋白表达量显著升高,BCRP蛋白表达量显著降低(P<0.01);与模型组比较,温阳复元方组和miR-137模拟组中TFR 蛋白表达量显著降低(P<0.01),BCRP 蛋白表达量显著升高(P<0.01),其中miR-137模拟组较为显著;与miR-137模拟对照组相比,miR-137模拟组TFR蛋白表达量显著降低,BCRP 蛋白表达量明显升高(P<0.01),于7 d表达量最为显著。

表5 各组大鼠脑组织TFR、BCRP蛋白相对表达量比较

图2 各组大鼠TFR(左)、BCRP(右)蛋白表达电泳图

3 讨 论

扶阳学派认为中风的基本病机为元阳亏虚,脏腑温煦功能失调,阴寒内生,导致寒凝血瘀;痰瘀阻滞又进一步阻遏阳气的化生,导致肝风夹痰上蒙清窍,发为中风。基于“阳虚为本”的核心病机,创制温阳复元方治疗本病。本方是由白附片、黄芪、党参、石菖蒲、淫羊藿、田三七、干姜、炙甘草等药物组成,方中白附片可温阳行水,大补少阴之肾阳为君药。臣以黄芪补气升阳,大补脾胃之气,气行则血行,有行滞通络之效;党参助黄芪补脾肺之气;辛热之干姜温中散寒,助附子温脾胃之阳。淫羊藿引阳入阴,通达内外;石菖蒲化痰通窍;田三七活血散瘀通络;上三药为佐药,炙甘草为使药。诸药合用,共奏温阳益气、化痰通络之功。课题组前期大样本多中心的临床试验研究发现,本方能明显改善缺血性中风患者的神经功能和日常生活能力,这也为本方在临床和基础实验研究方面奠定了重要基础[8-11]。

FPT是一种铁依赖形式的调节性坏死,通过影响铁代谢或脂质过氧化在IS的发展中起着重要作用。多项证据研究证实[12-13],抑制线粒体铁死亡通路可以有效改善缺血性脑损伤,减轻神经缺损功能障碍。最新研究显示[14],转铁蛋白受体(TFR)可以介导铁蛋白从细胞外进入细胞,是一种通过与转铁蛋白结合参与控制细胞铁供应的膜受体,机体中血清Fe3+可以通过TFR还原为Fe2+,再经二价金属离子转运体DMT1转入内皮细胞质,而在缺血缺氧状态下TFR的高表达加速诱导铁死亡[15-16]。因此,TFR被认为是铁死亡发生的标志蛋白之一;而胸腺癌抵抗蛋白(BCRP)作为一种血红素铁输出蛋白,可以代谢过量的卟啉和血红素,维持细胞内环境稳态[17]。同时,当机体发生缺血缺氧后,两种蛋白的功能和转化形式进一步发生改变,从而导致血脑屏障的转运系统发生紊乱,最后发生脑组织损伤。因此,调控铁死亡通路上相关蛋白表达可能更好地发挥脑保护作用[18]。研究[19]发现干细胞中的BCRP表达通过防止导致线粒体死亡的血红素积累来保护造血干细胞免受缺氧环境的影响,提高细胞在缺氧状态下的存活率。此外,大鼠脑缺血后海马CA2区BCRP的表达量减少,可以进一步通过药物干预增加其表达效应,发挥神经保护作用[20]。

MicroRNA作为微小RNA,是一种负调控基因表达的小非编码RNA分子[21-22],已经成为中枢神经系统损伤新的治疗靶点。同时,miR-137作为脑特异性的 miRNA,已经被证实可以通过其过表达抑制氧-葡萄糖剥夺和再氧合(OGD/R)模型下相关因子的上调或下调,从而进一步有效改善局灶性脑缺血后的损伤[23]。miR-137还可能通过抑制炎症标志物的释放来减少脑梗死体积,改善MCAO大鼠的认知功能[24]。

本次研究显示,大鼠脑缺血后TFR表达显著增加,而miR-137和BCRP表达明显下降,其直接结果导致铁离子内流增加,而外输减少,致使神经元线粒体结构破坏而铁死亡发生。外源性行miR-137过表达后发现,miR-137可上调BCRP表达,抑制TFR的表达,促进细胞内铁外排,减少神经元损伤。此外,我们进一步发现,温阳复元方联合miR-137可进一步调控线粒体铁死亡通路上相关蛋白和mRNA的表达效量,从而减少神经细胞过度损伤,发挥脑保护作用。温阳复元方的不同剂量可能有着不同程度上的治疗效果,因此在后续研究中,我们将继续完善实验分组设计。