回阳固本汤促进异基因造血干细胞移植后自然杀伤细胞重建的机制研究Δ

高小丽,何海涛,王 启,姚翔媚,秦 涛,张海溪,赵 婕,冯 帅,胡 芃,杨同华(云南省第一人民医院血液科,云南省血液系统疾病临床医学研究中心,昆明 650032)

异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前血液系统恶性疾病治疗的重要方法[1]。allo-HSCT的成功常受到急性移植物抗宿主病(aGVHD)的限制,由于缺乏有效的预测靶点和治疗措施,降低移植物抗宿主病的发病率和严重程度仍是目前allo-HSCT治疗的主要挑战[2-3]。多项证据表明,allo-HSCT后自然杀伤细胞(NK细胞)的早期重建与aGVHD的发病有着紧密联系,其活性的恢复对于allo-HSCT的成功至关重要[4-7]。因此,NK细胞的重建成为近年来allo-HSCT研究的热门话题。中医认为急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征或淋巴瘤等血液疾病大都具有共同的病机——脾肾阳虚,而脾肾两虚可造成阳气耗损、气血亏虚,治疗应以扶正固本为原则[8-10]。回阳固本汤具有补肾温阳、健脾固本的功效,是我院临床上脾肾阳虚型患者的常用药。本研究前期发现allo-HSCT患者在移植前服用回阳固本汤可以显著提高外周血NK细胞数量与活性,表明回阳固本汤可能作为allo-HSCT的辅助治疗药物。于是,本研究开展了相应的临床与基础实验以明确其具体功效和分子调节机制,为回阳固本汤在allo-HSCT治疗中的应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床研究

1.1.1 资料来源:选取2021年7月至2022年9月于我院血液科行allo-HSCT的患者40例。纳入标准:年龄14～55岁,原发疾病为血液系统恶性疾病,均为首次接受allo-HSCT;中医辨证为脾肾阳虚型,即四肢怕冷、纳差、便溏、乏力、腰膝酸软,脉沉或细,舌淡或胖大、苔白或白腻。排除标准:合并严重的心、肝、肾等脏器衰竭者;不能配合治疗与服药者;临床资料不全者。本研究为开放研究,根据患者选择的治疗方式分组,将20例allo-HSCT联合回阳固本汤的患者纳入HYGB组,将另外20例选择allo-HSCT单独治疗的患者作为对照组。两组患者的年龄、性别、原发疾病、供者类型、CD34+细胞输注量及移植后住院时间等一般资料具有可比性,见表1。本研究已通过我院医学伦理委员会审批(伦理审批号:KHLL2022-KY125),患者及其家属对本研究内容均已知情,并签署知情同意书。

表1 两组患者一般资料比较Tab 1 Comparison of general information between two groups

1.1.2 方法:所有患者均接受髓性预处理,亲缘全相合供者allo-HSCT的aGVHD预防采用环孢素A+甲氨蝶呤方案;亲缘单倍体供者采用环孢素A+甲氨蝶呤+吗替麦考酚酯方案预防aGVHD。HYGB组患者在最后1次化疗结束至移植预处理前服用回阳固本汤,连续干预4周。回阳固本汤配方:附子颗粒9 g,生姜30 g,炙甘草9 g,肉桂9 g,生晒参9 g,砂仁5 g,盐小茴香5 g,五味子5 g,当归9 g,黄连5 g,醋乌梅5 g,花椒5 g,鸡内金9 g,焦麦芽9 g;1日1剂,水煎服,分早晚2次温服。

1.1.3 疗效评定标准:造血重建标准:allo-HSCT结束后,在未使用粒细胞集落刺激因子的情况下,当中性粒细胞绝对值>0.5×109/L持续3 d,以第1日作为中性粒细胞植入日期;同时,在脱离血小板输注情况下,当血小板计数>20×109/L持续7 d,以第1日作为血小板植入日期[11]。中性粒细胞与血小板植入时间未超过28 d视作造血重建良好,否则视为造血重建不良。同时,统计90 d内复发及死亡例数。

1.2 细胞实验

1.2.1 材料:(1)仪器。CO2培养箱(美国Thermo Fisher公司);流式细胞仪(美国BD公司);聚合酶链反应(PCR)仪(美国ABI公司);电泳仪(北京六一生物科技有限公司);酶标仪(美国Molecular Devices公司);离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司);凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad公司)。

(2)试剂。人外周血单个核细胞(PBMC)分离试剂盒与人NK细胞分离试剂盒均购自天津科维诺生物科技有限公司;IMDM培养基、Hanks溶液购自美国Sigma公司;RNeasy提取试剂盒、逆转录试剂盒与SYBR Green试剂均购自德国QIAGEN公司;CCK-8溶液、磷酸盐缓冲液、重组白细胞介素(IL)15、胰蛋白酶与RIPA裂解缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司;所有抗体购自英国Abcam公司;10%人血清购自武汉艾美捷科技有限公司;Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2.2 方法:(1)NK细胞计数。分别于allo-HSCT前、allo-HSCT后第30、60和90日采集两组患者外周血4～5 mL,采用Hanks溶液等体积稀释后,使用人PBMC分离试剂盒、根据密度梯度离心法于1 500 r/min离心15 min(离心半径10 cm),获取PBMC,以磷酸盐缓冲液重新悬浮细胞,避光条件下采用PerCP-Cy5.5-抗CD3抗体、PE-抗CD56抗体、FITC-抗CD16抗体标记20 min,采用流式细胞仪分析CD3-CD56+CD16+NK细胞比例,以对照组作为基准,计算相对比例。

(2)NK细胞分离培养。随机选取对照组与HYGB组患者外周血各3份来提取NK细胞,分离PBMC,使用人NK细胞分离试剂盒分离NK细胞,分离后采用流式细胞仪鉴定CD3-CD56+CD16+,纯度为94.1%～96.8%。随后重悬1×106个细胞于IMDM培养基(含有10%人血清、0.5 g/mL IL-15),将培养基置于37 ℃培养箱中培养48 h后,进行以下实验。每实验设置3个复孔。

(3)实时荧光定量PCR。采用PCR检测外周血中CD15与CD56的表达量,首先使用RNeasy提取试剂盒提取PBMC中的总RNA,然后使用逆转录试剂盒合成cDNA,最后使用SYBR Green试剂进行实时荧光定量PCR,于PCR仪上分析并计算相对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达量(2-ΔΔCt法)。

(4)细胞活性检测。采用CCK-8法评价细胞活性,将分离培养的NK细胞以2×103细胞/孔的密度接种于96孔板中,分别培养0、24、48和96 h,向每个孔中加入CCK-8溶液(10 μmol/L)于37 ℃孵育2 h后,用酶标仪测量细胞在450 nm波长下的吸光度(OD值)。

(5)细胞凋亡分析。收集细胞并将细胞密度调整为1×106个/mL,使用胰蛋白酶消化后,分别与Annexin V-FITC、PI结合缓冲液混合,孵育30 min,采用流式细胞仪分析细胞凋亡率。

(6)蛋白质印迹法。以RIPA裂解缓冲液提取NK细胞总蛋白,凝胶电泳分离蛋白条带并转膜,使用1∶1 000稀释的一级抗体进行蛋白质印迹分析,随后与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育,使用凝胶成像分析仪进行拍照,并使用Image J软件量化条带强度,以GAPDH作为内参,计算相对表达量。每样本设置3个重复,计算平均值。

(7)细胞分组干预。从患者外周血中分离培养NK细胞,分为对照组、HYGB组和LY294002组,HYGB组细胞采用回阳固本汤干预,LY294002组细胞在回阳固本汤干预的同时加入LY294002 50 μmol/L干预24 h,随后分别检测各组细胞活性与凋亡情况。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 allo-HSCT患者近期临床效果评价及不良反应发生情况分析

两组患者在移植后90 d内均未发生移植相关死亡,对照组90%(18/20)的患者造血重建良好,HYGB组100%(20/20)的患者造血重建良好。在移植后3个月内,对照组患者复发2例,非移植相关死亡1例;HYGB组患者复发1例,未出现死亡。两组患者近期疗效比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表2。同时统计患者不良反应发生率,结果显示,两组患者消化道症状(恶心、呕吐和腹泻)、感染和肝功能损害的发生率比较,差异均无统计学意义(P>0.05);HYGB组患者aGVHD发生率显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表2 两组患者allo-HSCT后临床效果比较[例(%)]Tab 2 Comparison of clinical effects between two groups after allo-HSCT [cases (%)]

表3 两组患者allo-HSCT后90 d内不良反应比较[例(%)]Tab 3 Comparison of adverse drug reactions within 90 d after allo-HSCT between two groups [cases (%)]

2.2 回阳固本汤对allo-HSCT后患者体内CD3-CD56+CD16+ NK细胞比例的影响

allo-HSCT进行0 d时,两组患者CD3-CD56+CD16+NK细胞比例,CD56、CD16表达量的差异均无统计学意义(P>0.05);但allo-HSCT后30、60和90 d时,HYGB组患者CD3-CD56+CD16+NK细胞比例,CD56、CD16表达量显著高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),见图1。

2.3 回阳固本汤对allo-HSCT患者来源NK细胞体外活性的影响

与对照组相比,HYGB组患者NK细胞活性显著升高,细胞凋亡率显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05),见图2。

A.CCK8实验检测NK细胞在450 nm处的吸光值;B—C.流式细胞术测定两组NK细胞Annexin V-FITC/PI双染情况与细胞凋亡率;n=3,*P<0.05。A. absorbance of NK cells at 450 nm detected by CCK8 assay; B-C. Annexin V-FITC/PI double staining and apoptosis rate of NK cells in both groups detected by flow cytometry; n=3, *P<0.05.图2 回阳固本汤对allo-HSCT患者来源NK细胞体外活性影响Fig 2 Effects of Huiyang Guben decoction on in vitro activity of NK cells derived from allo-HSCT patients

2.4 回阳固本汤对患者来源NK细胞内PI3K/Akt信号通路的影响

与对照组相比,HYGB组患者NK细胞内磷酸化的PI3K(p-PI3K)和磷酸化的Akt(p-Akt)的表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),而HYGB组与对照组总的Akt和PI3K表达水平的差异无统计学意义(P>0.05),见图3。

2.5 PI3K抑制剂对回阳固本汤提高NK细胞体外活性的影响

与HYGB组比较,HYGB+LY294002组NK细胞活性显著降低,而细胞凋亡比例显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05),该结果逆转了HYGB提高NK细胞活性的效果,见图4。

A.CCK8实验检测三组NK细胞在450 nm处的吸光值;B—C.流式细胞术测定三组NK细胞Annexin V-FITC/PI双染情况与细胞凋亡率;n=3,*P<0.05。A. absorbance of three groups of NK cells at 450 nm detected by CCK8 assay; B-C: Annexin V-FITC/PI double staining and apoptosis rate of NK cells in three groups detected by Flow cytometry; n=3, *P<0.05.图4 PI3K抑制剂对回阳固本汤提高NK细胞体外活性的影响Fig 4 Effects of PI3K inhibitor on enhancement of NK cell activity in vitro by Huiyang Guben decoction

3 讨论

NK细胞是机体免疫防御的前线细胞,能够识别并杀死恶性肿瘤细胞或病毒感染细胞[12-13]。目前,人们对NK细胞相关分子调节通路的理解仍显不足,NK细胞在防止allo-HSCT后aGVHD的潜力,值得更进一步研究探索。

目前,中药汤剂已被广泛用于多种疾病的临床治疗,包括各类血液系统疾病。张国梁等[14]指出,采用髓白1号方联合化疗治疗急性髓细胞白血病,显著提高了患者的缓解率,降低了复发率;王永敏等[15]发现,益髓补肾方可以显著增强患者的免疫功能,改善恶性淋巴瘤化疗患者相关性贫血。本研究首先采用回阳固本汤辅助allo-HSCT治疗血液系统恶性疾病患者,结果发现,回阳固本汤虽然在疗效改善方面与对照组的差异无统计学意义(P>0.05),可能是由于样本数量偏小导致的差异不显著;但数据显示,回阳固本汤可显著降低患者移植后9个月内aGVHD的发生率。中医认为,各类血液系统恶性疾病,无论是急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、骨髓增生异常综合征或高侵袭性淋巴瘤等,都源于气血不足,毒邪侵体,与西医的自身免疫功能低下的病因相通[16-18]。因此,其治疗应以扶正为主,鼓舞正气,解毒为辅,抵御毒邪,增强机体免疫功能,恢复各脏器功能,为移植后造血干细胞的存活、分化创造条件。回阳固本方中,制附片回阳救逆、补火助阳;生姜与黄连解毒;炙甘草作为补益剂,具有益气滋阴、通阳复脉的功效;姜半夏消痞散结;生晒参具有补元养血、调节心血管系统及免疫功能的作用;当归补血活血;各药合用,共奏回阳固本之效。

在分子机制上,本研究结果发现,接受回阳固本汤干预的患者,其外周血NK细胞比例显著升高,且NK细胞体外增殖活性增强,凋亡率降低。该结果说明,回阳固本汤可以促进NK细胞的早期重建,提高NK细胞活性。此外,本研究结果显示,回阳固本汤显著激活了NK细胞中的PI3K/Akt通路。PI3K/Akt信号与细胞增殖、凋亡等细胞生物学过程密切相关,并且多项研究结果证实该信号参与了NK细胞活性的调控[19-20]。本研究通过体外细胞实验继续探究PI3K/Akt是否参与了回阳固本汤对NK细胞活性的调控,采用PI3K抑制剂LY294002协同回阳固本汤一起干预NK细胞,结果显示,LY294002导致NK细胞增殖活性降低、凋亡率升高,逆转了回阳固本汤在体外促进NK细胞活性的效果。

本研究报道了回阳固本汤用于辅助allo-HSCT治疗的增益作用,并揭示了详细的分子调控机制。但是本研究也存在一定的局限性:(1)由于实验条件的限制,本研究中未能探究回阳固本汤对于NK细胞分型及杀伤活性的影响机制;(2)本研究中的临床研究仅为单中心、小样本研究,可能导致结果呈现一定程度的偏倚,未来或可联合多中心进行更大样本的临床研究,以验证本研究结论。

综上所述,回阳固本汤通过激活PI3K/Akt通路促进了allo-HSCT后NK细胞的重建与活性维持,将有助于预防治疗过程中aGVHD的发生,并可能进一步提升allo-HSCT成功率。本研究结果可能为回阳固本汤在allo-HSCT治疗中的应用提供科学的理论依据。