坏死性凋亡在眼科的研究进展及其抑制剂的临床应用

颜鑫霖 李轩

南开大学附属眼科医院 （天津 300020）

坏死性凋亡也称程序性坏死，是程序性细胞死亡的另外一种主要方式。坏死性凋亡不同于凋亡，会发生质膜破裂，引起周围组织炎性反应。目前，对于坏死性凋亡的研究在很多学科中已经有了一定的进展，而在眼科学中的研究相对较少。本文将对在眼科学中已经有结论的研究以及其抑制剂的治疗进展和临床应用做一综述，旨在为今后眼科学中坏死性凋亡更进一步的研究提供参考。

1 坏死性凋亡机制及其抑制剂的研究进展

1.1 坏死性凋亡背景介绍 程序性细胞死亡是生物体发育分化过程中普遍存在的，一种由基因决定的主动有序的细胞死亡方式。其包括了胚胎发育、维持组织稳态以及宿主对病原体免疫防御的生物过程。从程序性细胞死亡的发生机制上来分类，其可分为凋亡、坏死性凋亡、焦亡、铁死亡、自噬依赖性细胞死亡等。1988 年，LASTER 等［1］首先发现坏死性凋亡这一有别于凋亡以及坏死的新的死亡方式。2000 年，受体相互作用蛋白1（receptor-interacting protein 1，RIP1）作为坏死性凋亡通路中的第一个核心信号分子被HOLLER 等人发现。2005 年，DEGTEREV 等人将这种非凋亡性的细胞死亡方式命名为坏死性凋亡。坏死性凋亡的特点主要包括在坏死过程中产生活性氧以及炎性因子，DNA 降解，并且通常产生坏死小体（necrosome）。其形态学特征表现为细胞膜完整性结构受到较明显地破坏，染色质颗粒呈不连续可逆性凝结、为白色絮状，细胞器显著肿胀、内质网显著崩解，细胞体积可因局部肿胀而明显变细膨大，基因组和DNA 均被细胞随机降解、电泳图谱可显示细胞呈涂抹状。坏死形成的生化过程亦常同时涉及细胞局部炎症渗出等多种反应，并有的可长期持续并释放出大量细胞内容物，残余留存下来的细胞碎片则常能被人体外源巨噬细胞彻底吞噬［2］。目前，已经在人体多个系统的疾病中发现了坏死性凋亡的参与，包括神经系统（如阿尔茨海默症），心血管系统（心肌梗死），呼吸系统（急性呼吸窘迫综合征），眼部疾病（青光眼）等［3］。

1.2 坏死性凋亡的分子机制 肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNFα）介导的坏死性凋亡是最经典的通路［4］。TNFα 是一种重要的促炎细胞因子，参与介导多种人类的炎症性疾病以及退行性疾病。在这个通路中，泛素化和磷酸化过程起到了重要作用（图1）。当TNFα 与肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）结合后，可使TNFR 结构发生改变，RIP1、肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白（TNFR-sociated death domain，TRADD）、TNFR 相关因子2/5（TNFR-associated factor 2/5，TNFR2/5）、胞内凋亡蛋白抑制因子1/2（cellular inhibitor of apoptosis protein 1/2，cIAP1/2）、线性泛素链组装复合物（linear ubiquitin chain assembly complex，LUBAC）、去泛素化酶（cylindromatosis，CYLD）等蛋白形成复合物I。在复合物I 中，cIAPs 和LUBAC 通过K63 连接的泛素链以及线性泛素链促进了RIP1 的泛素化，继而引起了TAK 结合蛋白2/3（TAK1-binding protein 2/3，TAB2/3）的招募，促进了对转化生长因子β 激活激酶1（transforming growth factor-β activated kinase 1，TAK1）的激活，形成TAK1-TAB2-TAB3 复合物，同时携带有核因子κB 关键调节基因（nuclear factorκB essential modulator，NEMO）的调节亚基的抑制性蛋白激酶（inhibitor of κB kinase，IKK）组成IKKα/IKKβ/NEMO 复合物，激活NF-κB 信号通路使细胞存活。当NF-κB 受体的靶蛋白的表达过程被环己酰亚胺受体选择性抑制并阻断通路时，由TRADD、Fas 死亡结构域相关蛋白（Fas-associated protein via death domain，FADD）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（cysteinyl aspartate specific proteinase 8，caspase8）所组成的复合物Ⅱa 激活，通过下游信号通路诱导非RIP1 依赖性细胞凋亡。而当RIP1 泛素化过程受到抑制时，会导致由RIP1、FADD、caspase8 组成的复合物IIb 形成，该复合物可通过激活caspase8 的活性来激活RIP1 依赖性细胞凋亡。当caspase8 活性受到抑制后，RIP1 通过同型相互作用基序RHIM（图2）与RIP3 相结合，并通过自磷酸化或互相磷酸化激活，该复合物为坏死性凋亡的核心执行复合体，构象上呈淀粉样。接着，由N端四螺旋束结构域（4HBD）和C 端假激酶结构域所组成的混合谱系激酶结构域样蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）被RIP3 激活，形成坏死复合物necrosome（复合物IIc），MLKL上的Thr357 和Ser358 位点被磷酸化，转化为开放的活性构象，暴露了其四螺旋束结构域，从而促进了MLKL 的寡聚，形成依赖二硫键的类淀粉样RIP1-RIP3-MLKL 复合体。然后磷酸化的MLKL 通过高尔基体-微管体-肌动蛋白机制移动到质膜，通过紧密连接蛋白形成孔隙或选择性地调节调节离子通道，使钙、钠、钾离子内流，细胞内外渗透压均发生明显改变，最后形成细胞膜的破裂变性而坏死［5-7］。

图1 TNFα 介导的坏死性凋亡信号通路图Fig.1 TNFα-mediated signaling pathways of necroptosis

图2 RIP1 和RIP3 的结构示意图Fig.2 Domain structure of RIP1 and RIP3

尽管RIP1 是TNF 介导的坏死性凋亡信号通路中的必要分子，但它并不是其他通路的必要条件，除了经典的TNF 信号通路外，还存在由其他的信号通路介导坏死性细胞凋亡过程的发生。如当病毒感染或感知细胞内源性RNA 后，Z-DNA 结合蛋白（另一种含有RHIM 的蛋白质）通过RHIM 同源相互作用招募并磷酸化RIP3，激活的RIP3 磷酸化MLKL 从而引起坏死性凋亡［8］。该过程不需要RIP1 的参与。

1.3 坏死性凋亡抑制剂的治疗进展以及临床应用 随着对坏死性凋亡研究的深入，其抑制剂的种类和机制也取得了一定进展。Necrostatin-1（Nec-1）是坏死性凋亡的经典抑制剂，其通过与死亡结构域受体相互作用，抑制了RIP1 的自磷酸化，从而阻止RIP1-RIP3-MLKL 的信号传导过程［9］。目前已经证实Nec-1 在呼吸系统、消化系统、神经系统等领域可以通过阻断坏死性凋亡而展现出保护作用［10］。Nec-1 也有其副作用，如脱靶效应以及半衰期短等弊端。目前，针对坏死性凋亡的其他药物也在不断研发。近年来，针对RIP3 靶点的药物GSK2399872A（GSK872）在眼科领域的研究中证明其对坏死性凋亡的治疗作用。有研究［11］报道GSK872 可以在体内外的细胞兴奋性毒性模型中抑制视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）的坏死性凋亡过程，同时抑制炎症小体激活，从而提供新的神经保护治疗方法。TC13172 是MLKL 的特异性抑制剂［12］，通过与MLKL 的半胱氨酸共价结合，抑制MLKL的寡聚化，显著抑制MLKL向胞膜的移动。

目前，针对RIP1 位点的抑制剂在类风湿性关节炎、阿尔茨海默症等疾病正处于Ⅰ期或Ⅱ期临床研究中［13］，RIP1 抑制剂在患者中的临床试验仍处于早期阶段。迄今为止，具有适当体内活性的RIP1 抑制剂已经开发出来。而开发具有选择性、强效性和更安全性的RIP1 小分子抑制剂，寻找能可靠测量其临床疗效的生物标志物仍然是未来临床发展面临的挑战。在眼科领域，坏死性凋亡抑制剂的相关研究也证明其对眼部坏死性凋亡相关疾病的保护作用。随着对坏死性凋亡抑制剂在临床的不断探索，可抑制靶点也不断被发现。今后研究可以针对不同治疗靶点的结合以及寻找新的特异性更强的靶点，从而使坏死性凋亡的治疗形成体系。由于目前眼科尚未有针对坏死性凋亡靶点相关的临床实验，因此，应借鉴其他领域已经在临床实验中所取得的成果，从而开展坏死性凋亡相关眼科疾病的临床研究。

接下来，对眼科领域已取得的坏死性凋亡研究成果做一总结，为今后临床研究做为参考。

2 坏死性凋亡在眼科的研究进展

2.1 坏死性凋亡在角膜疾病的研究进展 角膜常直接与外界接触，容易受到损伤和感染，因此角膜疾病尤为多见，是致盲的重要眼病之一。各种原因产生的物理、化学、生物损伤都会引起角膜的水肿、混浊、溃疡、穿孔、新生血管，导致角膜的屈光改变和透明性下降。尽管目前临床上有药物以及手术的治疗方案应对各种类型的角膜疾病，但是很多角膜疾病的预后都会导致视力不可逆的下降，因此，对角膜疾病机制的了解将有助于开发新的治疗靶点。

在感染性角膜炎中，坏死性凋亡的作用已被证实。医疗器械，如隐形眼镜，可以使细菌直接接触人体角膜上皮细胞。BROTHERS 等［14］报道在细胞溶解素诱导角膜上皮细胞坏死性凋亡的模型中，奇异变形杆菌和粘质沙雷氏菌的ShlA 家族细胞溶解素介导上皮细胞孔隙产生，从而激活坏死性凋亡过程，而气泡产生和细胞死亡的过程可以被RIP1 和MLKL 抑制剂阻断。在细菌性角膜炎情况下，该病理过程可以迅速通过角膜上皮而侵入角膜基质，而细菌在角膜基质中更容易增殖，因此，将坏死性凋亡过程限制在角膜上皮中可以减轻组织损伤以及角膜炎的严重程度。而GUO等［15］人报道，在HSV-1 型感染性角膜炎小鼠模型中，caspase8 以及RIP3 基因双敲小鼠角膜感染7 d后收集的泪膜均含有感染性病毒，比野生型动物泪膜中观察到的感染率明显升高。同时12%的野生型小鼠出现脑炎并死亡，而50%的RIP3 缺陷小鼠以及78%的caspas8 以及RIP3 基因双敲小鼠出现脑炎并死亡。表明外源性凋亡和坏死性凋亡有助于HSV1 急性感染期间对脑炎的抵抗。RIP3 介导的坏死性凋亡通路抑制了病毒在角膜层面的复制，从而对单纯疱疹病毒性角膜炎起到了保护作用。上述研究结果表明，坏死性凋亡参与了部分感染性角膜炎的病程，而其在不同种疾病中起到不同的作用，如何调控坏死性凋亡在感染性角膜炎中的发展过程也是今后研究的方向之一。

坏死性凋亡在角膜新生血管性疾病中也扮演着重要角色。RIP1 在炎症细胞中表达升高，在调节细胞凋亡、坏死性凋亡以及炎症中发挥重要作用。在血管生成过程中，浸润的巨噬细胞中RIP1表达增加。使用RIP1 基因缺陷的小鼠或抑制剂Nec-1 进行干预，可减弱激光、基质栓塞和碱损伤诱导的小鼠角膜新生血管生成［16］。表明RIP1 激酶抑制可介导caspase 通路激活，使浸润的巨噬细胞增多，随即减轻病理性血管生成过程，提示了RIP1 激酶的抑制在病理性血管生成中具有治疗作用。而RIP1 是坏死性凋亡通路中的重要一步，其在坏死性凋亡与眼部新生血管性疾病之间的联系还需进一步研究。

干眼与坏死性凋亡之间也存在着密切联系。最近研究认为，基于免疫的炎症反应、细胞凋亡等是干眼症发生发展的相关因素。眼表是眼睛结构的最外层，经常暴露在环境空气中。这使得它特别容易受到外部空气污染物（如PM 颗粒）的影响［17］。SHI 等［18］在体内以及体外实验中发现PM颗粒通过坏死性凋亡可以诱导角膜炎症，减少粘蛋白的产生而导致眼表损伤引起干眼症。Nec-1通过抑制坏死性凋亡，可以显著减轻PM 诱导的眼表损伤、炎症和粘蛋白分泌不足。这表明PM 可以通过角膜炎症以及减少粘蛋白的产生介导坏死性凋亡引起干眼症，而Nec-1 具有预防以及治疗PM暴露相关的干眼症的潜力。干眼症的病因还包括睑板腺功能异常、水液层泪腺泪液分泌不足等原因，这些病理过程是否存在坏死性凋亡的参与还需进一步研究验证。

外用滴眼液对于治疗眼科疾病至关重要，但是在其临床浓度的使用中也会引起角膜细胞的坏死性凋亡产生而带来副作用。近年来，对于药物所致的坏死性凋亡的研究也有了一定的进展。YOU 等［19］通过体外和体内模型发现10%苯肾上腺素可引起兔角膜上皮细胞的破坏和凋亡。10% ～1.25%苯肾上腺素通过RIP1-RIP3-MLKL 级联反应引起人角膜上皮细胞坏死性凋亡，0.625%苯肾上腺素通过线粒体依赖和死亡受体介导的信号通路诱导角膜上皮细胞凋亡。可见同一信号通路的上游元素在不同浓度刺激条件下可以诱导出不同的细胞死亡方式。JIANG 等［20］发现高浓度（0.5%和0.25%）噻吗洛尔可以诱导兔角膜缘干细胞发生坏死性凋亡。因此，研究滴眼液对于角膜上皮的毒性及其作用机制，对制定安全有效的临床用药策略具有重要意义。但是降低药物浓度后是否能达到临床有效性还需要进一步研究，在药物的临床安全性基础下选取最适宜浓度是今后研究的重要方向。

2.2 坏死性凋亡在青光眼中的研究进展 青光眼是一组以视力下降、视乳头萎缩变形及凹陷、视野缺损为共同特征的疾病，导致视功能损害的病理基础是RGC 进行性死亡和视神经纤维丧失。视神经供血不足、病理性眼压增高等因素是其发病的原发危险因素。近年来，许多研究发现坏死性凋亡参与了青光眼的发生与发展。

筛板是青光眼中视神经损伤的原发部位，眼压升高引起的筛板变形与视野缺损和视神经损伤直接相关，有研究表明，青光眼患者在眼压升高的情况下，筛板的孔隙形状会发生变形。而眼压升高可以引起RGC 层特异性细胞外基质成分变化，使异常的细胞外基质重塑，表明RGC 细胞的死亡与眼压升高密切相关。SHANG 等［21］发现，在急性高眼压和氧糖剥夺模型的早期阶段，RIP3 明显上调，表明这个过程中有坏死性凋亡的参与。静水压升高处理后正常RGC-5 组的丙二醛和糖原磷酸化酶水平明显高于RIP3 敲除组。在使用活性氧清除剂处理后，RGC-5 坏死性凋亡数量明显减少。表明高眼压诱导的RGC-5 坏死性凋亡过程是通过RIP3 介导的，该过程涉及糖原磷酸化酶激活以及活性氧的积累。LIAO等［22］发现，高眼压模型中，RIP3 和MLKL 的磷酸化和未磷酸化形式均上调，而RIP3 的抑制剂GSK872 则降低了同一时期磷酸化的MLKL 的表达。此外，还有研究发现钙蛋白酶可能通过调节RGC-5 中的截断型凋亡诱导因子激活坏死性凋亡过程。延缓甚至阻止RGC 细胞死亡是治疗青光眼的重要方向，而青光眼疾病中RGC 细胞的死亡过程分子机制非常复杂，高眼压模型中涉及RGC 细胞坏死性凋亡的过程，但其调控的相关机制还需要进一步的研究验证。因此通过坏死性凋亡通路中的治疗靶点可以为临床上早期治疗青光眼提供新方向，同时联合降眼压等常规治疗，从而探索出新的青光眼治疗方案。

缺血再灌注损伤是在缺血性损害的基础之上发展而来，再灌注后可以使可逆性损伤加重，甚至发展为不可逆性损伤，因此会多视网膜的功能产生重大影响，是青光眼相关的病理损伤之一。KIM 等［23］发现，视网膜缺血再灌注损伤后，内、外核层以及神经节细胞层的视网膜细胞数量减少，其表达的TNFα、RIP1、RIP3 和非活性caspase8 增加，使用坏死性凋亡抑制剂Nec-1 后可降低RIP1水平并减少视网膜细胞死亡。表明Nec-1 能减少缺血再灌注损伤模型中坏死性凋亡造成的RGC 损伤，同时也证明视网膜缺血再灌注损伤过程中存在坏死性凋亡的参与。氧化应激也是青光眼相关缺血再灌注损伤的重要因素之一，DING 等［24］发现，在氧糖剥夺细胞模型中，RIP3 敲除后的RGC-5坏死性凋亡数量减少，同时发现RIP3 可能通过ROS 积累进而诱导RGC-5 的坏死性凋亡。因此，深入探索坏死性凋亡在缺血再灌注损伤中的机制以及相关的调控作用，尤其是对于视神经以及视网膜的保护作用方面，将有可能为青光眼的治疗提供一种新的思路。

2.3 坏死性凋亡在视网膜疾病的研究进展 光感受器细胞等视网膜细胞在维持视网膜的功能上发挥了重要作用，而发生各种病理类型的视网膜疾病可以导致视网膜细胞死亡。近年来，坏死性凋亡在视网膜疾病如年龄相关性黄斑病变、视网膜脱离中的研究都取得了一定的进展。

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD），双眼先后发病或同时发病，并且进行性损害视力，严重影响老年人的生存质量，是发达国家老年人失明的主要原因。干性AMD色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）增生异常或萎缩，中心凹光反射消失，后极部色素代谢紊乱，表现出地图样萎缩的特征。HAMS 团队通过碘酸钠的氧化应激反应在体内和体外模型中诱导出了RPE 细胞的坏死性凋亡，使用抑制剂Nec-1 可以抑制RPE 细胞对碘酸钠的反应［25］。JANG 等［26］在碘酸钠处理的兔子和碘乙酸处理的猪模型中，使用RIP1 抑制化合物进行治疗，并在眼底检查和视网膜电图分析中一致证明了其对视网膜的保护作用。上述研究均表明AMD 过程存在着坏死性凋亡的参与，由于RPE 细胞的解剖定位以及代谢功能，其在干性AMD 中受损最为严重，因此，对于干性AMD 的治疗应主要考虑RPE 细胞的保护层面。眼底疾病的给药方式需要谨慎考虑，如使用滴眼液则需具有良好的角膜穿透性以及视网膜药代动力学，其产生的药效以及毒副作用也应在临床实验中得到验证。总之，通过对RPE 细胞坏死性凋亡的深入研究，尤其是阻断坏死性凋亡过程，有望为治疗AMD 尤其是干性AMD 的治疗提供新的方向。

视网膜脱离是视网膜的神经上皮层与色素上皮层的分离。感光细胞的丧失是视网膜脱离后视力丧失的重要原因，近年来，有研究表明视网膜脱离过程中光感受器细胞死亡过程中有坏死性凋亡机制的参与。DING 等［27］发现，在实验性视网膜脱离后，应用caspase 抑制剂z-vad-fmk 可抑制细胞凋亡，但增加了RIP 介导的坏死性凋亡水平。DONG 等［28］在SD 大鼠注射慢病毒以抑制CYLD 表达的模型中发现，下调CYLD 可以通过减少caspase8 的激活来抑制视网膜脱离后光感受器细胞凋亡，增加RIP1 的泛素化和抑制磷酸化来抑制坏死性凋亡，激活NF-κB 途径以保护感光细胞。DARUICH 等［29］发现转铁蛋白可以减少视网膜脱离诱导的细胞凋亡和坏死性凋亡，补充转铁蛋白可以作为手术的辅助药物治疗。过去的研究认为视网膜脱离过程中光感受器细胞存在着细胞凋亡，随着对视网膜细胞死亡方式的深入研究，逐渐发现坏死性凋亡在视网膜脱离中扮演着重要角色，近年来其在视网膜脱离中的作用和机制也被慢慢揭开。因此联合阻碍视网膜脱离后的凋亡与坏死性凋亡，可以更大程度地增加光感受器细胞的存活率，但是其对受损视网膜的远期保护作用还需进一步研究。

3 总结

坏死性凋亡是近十几年来细胞死亡领域的重大发现。目前已经在人类的多系统的退行性以及炎症性疾病中发现有坏死性凋亡的参与。尽管近年来对坏死性凋亡通路中的调节因子已被揭示，但是部分修饰作用，如RIP3 和MLKL 在坏死复合物中的泛素化过程机制仍不清楚。目前在眼科领域，已经从多种疾病模型中发现了坏死性凋亡通路的激活。坏死性凋亡抑制剂除了较早发现的Nec-1外，针对RIP3靶点的GSK872以及针对MLKL靶点的抑制剂TC13172 等新型抑制剂在细胞死亡机制方面的研究取得了重大突破。坏死性凋亡抑制剂在眼科的体内体外模型中也证明了其保护作用，但是现有的研究尤其临床研究相对较少，目前临床以及临床试验也没有针对坏死性凋亡靶点的滴眼液等药物的应用。本文着重对坏死性凋亡的分子机制及其抑制剂在眼科领域的研究成果做一总结，希望能为今后坏死性凋亡在眼科疾病中调控机制的相关研究做一参考，从而推进相关分子靶向药物的研发。

【Author contributions】YAN Xinlin wrote the article.LI Xuan revised the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.