梨果实发育过程中酚类物质组成及抗氧化活性比较

卢登洋， 王鑫， 唐章虎， 吴翠云*， 蒲云峰，闫敏， 鲍荆凯， 姜喜*

（1.塔里木大学园艺与林学学院，南疆特色果树高效优质栽培与深加工技术国家地方联合工程实验室，新疆 阿拉尔 843300； 2.新疆农业科学院轮台果树资源圃，新疆 巴音郭楞 841600； 3.塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300）

梨是蔷薇科（Rosaceae）梨亚科（Pomaceae）梨属（PyrusL.）落叶果树[1-2]，中国是梨的起源中心和主要的多样性中心之一，梨树在中国已有3 000多年的栽培历史[3-5]。梨味甜、汁液多、肉质脆，具有较多的营养物质和一定的保健功能[6-7]。近年来，随着人们对高品质生活的追求，越来越多的消费者喜欢具有一定营养保健功能的优良梨品种。大量研究表明，梨果实中的酚类物质是重要的抗氧化成分[8-10]，抗氧化活性是近年来研究的热点，也是反映水果品质的重要指标之一。

在梨果实发育过程中，果实中的总黄酮和总酚含量大部分都呈现下降趋势。研究发现，梨果实中的总酚含量、总黄酮含量和1,1-二苯基-2-苦肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylradical，DPPH）自由基清除能力随着果实发育呈逐渐降低的趋势[11-13]，且晚熟梨的总酚含量比早熟梨高30%～40%[14]。目前关于梨果实的多酚类物质的研究多以采后梨果实为试验材料，关于不同品种梨果实田间栽培过程中多酚类物质组成、含量和抗氧化活性变化规律的研究报道较少。本试验对白梨系统的砀山酥梨、西洋梨系统的库车阿木特、麻梨果实发育过程中多酚类物质组成、含量及抗氧化活性进行研究，调查不同梨品种多酚等功能性成分的动态变化，为3 种梨果实品质的形成规律和功能性新品种选育提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为砀山酥梨、库车阿木特和麻梨，均采自新疆农业科学院轮台果树资源圃。随机抽取常规管理、树势健壮、树冠大小基本一致且无病害的3株树，分别于盛花期后50 d（5月25日）开始，每隔15 d随机采集树冠外围中部、东、南、西、北5个方向、大小均匀一致且无病虫害的果实共30个，直至果实完全成熟（9月20日）。每次采集样品后置于冰盒中保存并迅速运回实验室备用。试验用芦丁和没食子酸购自阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备 将果实清洗干净、控干水分后，在每个果实中部位置横切约3 mm带皮果实切片，放到-20 ℃冰箱预冻后用真空冻干机冻干，然后用研磨仪打成粉末，放到-80 ℃超低温冰箱备用。精确称取1.000 g 冻干果肉，加入25 mL 乙醇超声30 min，并于5 000 r·min-1离心20 min，取上清液，重复3次。样液用于总黄酮、总酚、DPPH、2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2, 2’-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS+）含量测定和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。

1.2.2 总黄酮、总酚含量测定 总黄酮含量的测定采用硝酸铝比色法[15]，用芦丁作为标准品制作标准曲线，回归方程为y=0.225 7x+0.024 1（R2=0.991 8），将标准曲线中算出的结果换算为以每克梨果干重（dry weight, DW)中含芦丁当量（rutin equivalent,RE）毫克数表示（mg RE·g-1DW）。总酚含量的测定采用Folin-酚法[15]，用没食子酸作为标准品制作标准曲线，回归方程为y=1.866 7x+0.031 2（R2=0.998 5），将标准曲线中算出的结果换算为以每克梨果干重中所含没食子酸当量（gallic acid equivalent, CAE）毫克数表示（mg GAE·g-1DW）。

1.2.3 高效液相色谱分析 用外标法测定梨果实中的酚类物质组成与含量，具体色谱条件参照Pu等[16]的方法。

1.2.4 抗氧化活性测定 用DPPH、ABTS+自由基清除法[15]测定，以Trolox 作对照，DPPH、ABTS+自由基清除能力的标准曲线回归方程分别为y=4.940 1x-0.039 9（R2=0.996 0）、y=6.272 0x-0.028 4（R2=0.996 9），测定结果以每克梨果干重中所含维生素E 当量（vitamin E equivalent, TE）毫克数计（μmol TE·g-1DW）。

1.3 数据处理

用Excel 2019 分析测量数据，结合SPSS 17.0进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 梨果实发育过程中总黄酮、总酚含量的动态变化分析

2.1.1 梨果实发育过程中总黄酮含量的动态变化 由图1可以看出，3种梨果实在发育过程中总黄酮含量变化趋势基本一致，在盛花后50 d 时含量较高，随着果实的发育逐渐降低。果实发育前期，库车阿木特、砀山酥梨和麻梨的总黄酮含量降低迅速，由盛花后50 d 时的19.94、28.91 和23.41 mg RE·g-1DW 分别下降至80 d 时的10.20、10.12和9.82 mg RE·g-1DW，3个梨品种的降幅分别为48.83%、64.99%和58.04%；至果实成熟时，总黄酮含量分别降至4.35、0.60 和0.62 mg RE·g-1DW。3个梨品种果实中，幼果期总黄酮含量以砀山酥梨较高，库车阿木特果实中含量较低；而果实成熟时，库车阿木特果实中总黄酮含量明显高于麻梨和砀山酥梨，说明在果实发育过程中库车阿木特的总黄酮含量变幅较小，砀山酥梨的总黄酮含量变幅较大。

图1 梨果实发育过程中总黄酮含量的动态变化Fig. 1 Dynamic changes of total flavonoids content during pear fruit development

2.1.2 梨果实发育过程中总酚含量的动态变化由图2 可知，3 种梨果实的总酚含量在发育过程中变化基本一致。盛花后50 d时砀山酥梨和麻梨果实中总酚含量明显高于库车阿木特，分别达16.28和16.45 mg GAE·g-1DW，而库车阿木特果实中总酚含量为10.51 mg GAE·g-1DW；随着果实的生长，砀山酥梨、麻梨和库车阿木特果实中总酚含量80 d时分别下降至6.89、5.78 和6.44 mg GAE·g-1DW，3 个梨品种的降幅分别为57.65%、64.86% 和38.71%。在盛花后125 d 时库车阿木特果实中总酚含量降至最低，为2.95 mg GAE·g-1DW，此后维持在3.5 mg GAE·g-1DW 左右；砀山酥梨和麻梨中总酚含量在成熟时降至最低，分别为2.21 和1.51 mg GAE·g-1DW。在果实发育过程中，3 种梨果实的总酚含量均出现不同程度的波动，其中麻梨的总酚含量变动幅度较大，库车阿木特变幅较小。

图2 梨果实发育过程中总酚含量的动态变化Fig. 2 Dynamic changes of total phenol content during pear fruit development

2.2 梨果实发育过程中酚类物质组分含量的变化分析

HPLC 结果（图3）表明，3 种梨果实发育过程中共检测到13 种酚类物质。梨果实中的酚类物质含量均在幼果期较高，在成熟期含量较低；其中，熊果苷、槲皮葡萄糖苷、异鼠李素3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素酰化己糖苷等酚类物质含量随着果实的发育逐渐降低；儿茶素、山奈酚-双脱氧己糖苷、表儿茶素、槲皮素鼠李糖苷、芦丁、异鼠李素3-O-芸香苷、山奈酚3-O-芸香苷等酚类物质含量随着果实发育呈现出不断上下起伏的变化趋势，但其含量仍在幼果期较高。

图3 梨果实在发育过程中酚类物质组分含量变化Fig. 3 Changes of phenolic components during pear fruit development

在13 种酚类物质中，以熊果苷含量最高，平均达到3 353.43 μg·g-1DW，占总组分的51.88%；其次是绿原酸，平均含量为2 350.29 μg·g-1DW，占总组分的36.34%；其他酚类组分含量较低，在8.09～150.65 μg·g-1DW 之间，仅占总酚含量的0.13%～2.33%，其中含量最少的是异鼠李素酰化己糖苷。在幼果期，库车阿木特、砀山酥梨、麻梨的熊果苷和绿原酸含量分别是成熟期的5.36 和1.73倍、30.97和6.00倍、26.20和28.32倍。砀山酥梨果实中熊果苷、山奈酚-双脱氧己糖苷、绿原酸、山奈-3-氧-芸香苷、儿茶素、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷和异鼠李素酰化己糖苷含量均比库车阿木特和麻梨高。3种梨果实儿茶素、山奈酚-3-氧-芸香苷、表儿茶素、异鼠李素3-O-芸香苷和芦丁在果实发育期波动较大，不同品种之间存在差异。从HPLC结果可以看出，在梨果实发育过程中，砀山酥梨的熊果苷和绿原酸含量较库车阿木特和麻梨分别高49.40%和30.61%、57.34%和19.35%。

2.3 梨果实发育过程中抗氧化活性的动态变化分析

2.3.1 梨果实DPPH 自由基清除能力 从图4 可以看出，3种梨果实发育过程中的DPPH 自由基清除能力大致呈现出由高到低的变化趋势。在果实发育前期，库车阿木特、砀山酥梨和麻梨的DPPH自由基清除能力降低迅速，由盛花后50 d 时的63.89、68.06 和61.11 μmol TE·g-1DW 分别下降至80 d 时的28.18、25.93 和31.37 μmol TE·g-1DW，3 种梨的降幅分别为55.90%、61.90%和48.68%；库车阿木特和砀山酥梨的DPPH 自由基清除能力均在盛花后140 d 时达到最低，分别为17.00 和14.39 μmol TE·g-1DW，而麻梨在果实成熟期最低，为12.18 μmol TE·g-1DW。

图4 梨果实DPPH自由基清除能力变化Fig. 4 Changes in DPPH free radical scavenging capacity in pear fruit

2.3.2 梨果实ABTS+自由基清除能力 从图5 可知，3 种梨的ABTS+自由基清除能力在果实发育过程中呈现不断变化的趋势。在盛花后50 d时，砀山酥梨和麻梨果实中ABTS+自由基清除能力明显高于库车阿木特，分别达到164.60 和167.76 μmol TE·g-1DW，而库车阿木特果实中ABTS+自由基清除能力为102.64 μmol TE·g-1DW；随着果实的生长，盛花后65 d 时，麻梨、砀山酥梨和库车阿木特ABTS+自由基清除能力分别下降至88.88、62.21 和38.91 μmol TE·g-1DW，3 种梨的降幅分别为46.00%、60.53%和62.09%。在幼果期时，砀山酥梨和麻梨果实中ABTS+自由基清除能力较高，库车阿木特较低；而在果实成熟时，以砀山酥梨的ABTS+自由基清除能力最高，明显高于库车阿木特和麻梨。

2.4 梨果实发育过程中酚类物质与抗氧化活性的相关性分析

由表1可知，梨果实的抗氧化活性（即DPPH、ABTS+自由基清除能力）与总黄酮、总酚以及13种酚类物质的含量均存在正相关关系，3 种梨果实中总黄酮、总酚、熊果苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、绿原酸、儿茶素、异鼠李素酰化己糖苷和表儿茶素等物质与DPPH 自由基清除能力均存在极显著正相关关系（P＜0.01），且相关系数达0.95 及以上。梨果实中总酚、熊果苷、绿原酸、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-双脱氧己糖苷、槲皮素鼠李糖苷和山奈酚-3-O-葡萄糖苷等酚类物质与ABTS+自由基清除能力均存在极显著正相关关系（P＜0.01），且相关系数达0.90 及以上。芦丁、山奈酚-3-O-芸香苷与DPPH 自由基清除能力呈显著正相关（P＜0.05），相比之下相关性稍弱些，但对梨果实的抗氧化活性也可产生重要影响。

表1 不同品种梨果实发育过程中酚类物质与抗氧化活性的相关性分析Table 1 Correlation analysis between phenolic substances and antioxidant activity during fruit development of different pear varieties

3 讨论

多酚是梨果实中重要的功能成分，富含多酚的梨果实具有保健功能和较高的营养价值[12]。本研究所测试的库车阿木特、砀山酥梨、麻梨果实中总酚、总黄酮、酚类物质和抗氧化活性均存在差别。3 种梨果实的总黄酮和总酚含量在发育过程中变化基本一致，呈现出前期高、后期低的变化趋势，库车阿木特、砀山酥梨和麻梨在果实成熟期与幼果期相比，其总黄酮和总酚含量分别下降了87.20%、63.84%、97.93% 和 86.44%、97.33%、90.82%，与刘杰超等[17]发现枣果实在成熟期时总酚含量比幼果期低60%的研究结果相似。不同梨品种在不同发育期多酚物质含量变化趋势基本一致，但变化幅度差别较大[18]。因此，可以进一步研究品种间多酚积累规律，为培育具有特殊营养功能的优良梨品种奠定基础。

本研究显示，熊果苷、绿原酸是梨果实中最主要的酚类物质，而苹果中主要的多酚物质为绿原酸、表儿茶素、儿茶素和芦丁等[19]。在幼果期，库车阿木特、砀山梨和麻梨的熊果苷和绿原酸含量分别是成熟期的5.36 和1.73 倍、30.97 和6.00 倍、26.20和28.32倍，表明果实发育阶段越早，酚类物质越丰富，因此在梨树栽培管理中的疏果阶段，可以利用疏除的幼果提取其功能性成分，比如熊果苷的提取物可应用于美白化妆品，绿原酸的提取物可用于抗菌、抗病毒的保健品和药物，从而提高梨果的应用价值[20]。在3种梨果实发育过程中，熊果苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、绿原酸、异鼠李素3-O-葡萄糖苷、槲皮葡萄糖苷、异鼠李素酰化己糖苷等酚类物质含量呈下降趋势；麻梨的异鼠李素酰化己糖苷和异鼠李素3-O-葡萄糖苷在盛花后125 和140 d 均未测出。因此，不同品种间酚类物质的变化规律和范围略有不同[21-22]。

目前用于研究植物中抗氧化活性的方法有很多，但近年来最常用的方法是通过清除自由基的方法，这些方法有快速、简单、稳定的优点[23]。本文通过清除DPPH 和ABTS+的抗氧化能力来评价3 种梨果实发育过程中的抗氧化活性。抗氧化活性检测发现，在果实发育前期，库车阿木特、砀山酥梨和麻梨的DPPH 和ABTS+自由基清除能力逐渐降低，尽管在果实发育过程中，3 种梨果实的DPPH、ABTS+自由基清除能力呈现不完全一致的变化趋势，但总体砀山酥梨的抗氧化能力要强于其他2个品种。

相关性分析显示，3 种梨果实抗氧化活性与总黄酮、总酚以及13 种酚类物质含量均存在正相关关系，其中梨果实中总黄酮、总酚、熊果苷、儿茶素、绿原酸、表儿茶素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷和异鼠李素酰化己糖苷等物质与DPPH 自由基清除能力均存在极显著正相关关系（P＜0.01），且相关系数达到0.95及以上。梨果实中最主要的抗氧化活性成分是总酚、熊果苷、绿原酸等，与张云[24]和黄春辉等[25]在猕猴桃的研究中发现猕猴桃的抗氧化能力与总酚含量呈显著正相关的研究结果一致。