不同亚型CHO宿主细胞对抗体表达的影响

曹辉 ， 董静 ， 贾宇 ， 江一帆

华北制药集团新药研究开发有限责任公司，抗体药物河北省工程研究中心，抗体药物研究国家重点实验室，石家庄 050015

生物药物在国际医药市场中占据主导地位，截至2023年，全球范围内已有100多个抗体药物被批准上市，近1200个抗体药物处于不同临床试验阶段［1］。2021年全球畅销药品Top10中，生物药品占了7个，其中单克隆抗体药物4个，这些单抗药物均由重组中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞表达［2］。

CHO细胞在单抗工业生产中具有明显的优势，如表达产品具有和人类抗体类似的翻译后修饰；重组蛋白可胞外表达，便于目的蛋白分离纯化；CHO细胞由于非人源，可以减少人类病毒交叉污染的风险；同时CHO细胞具有较长的培养周期，可以进行无血清、高密度、悬浮大规模培养，从而获得高纯度目的蛋白［3-4］。随着CHO细胞的广泛应用，围绕CHO细胞开发的培养基、培养用设备、耗材种类日益丰富［5-7］，越来越多的开发项目也使得CHO细胞表达产品质量研究相对透彻，CHO细胞也成为目前市场上超过84%蛋白药物的首选宿主细胞［7］。

1957年，Puck通过中国仓鼠卵巢组织分离获得CHO细胞，1970年野生型CHO-K1保存于ATCC，1985年分离得到的CHO-K1亚克隆保存于ECACC［8-9］。此后多家药企使用悬浮培养基将野生型CHO-K1细胞悬浮驯化并作为宿主细胞使用，比如Merck、Lonza等公司。1973年Thompson从原始细胞中分离了1株可用于悬浮培养的CHO细胞，1980年Gibco公司将此细胞驯化至CD CHO培养基中，建立了CHO-S细胞和GMP细胞库。1983年，Urlaub等［9-10］通过突变一个基因，筛选出双等位DHFR基因敲除的CHO宿主细胞，并命名为CHO-DG44。图1展示了CHO细胞谱系。然而，由于培养条件、筛选方式等不同，不同CHO细胞在基因组、新陈代谢乃至细胞形态、生长方式、蛋白表达等方面具有较大的差异。

图1 CHO细胞谱系图Fig. 1 CHO cell lineage

1 CHO细胞不同亚型染色体差异

研究表明，ATCC保存的野生型CHO-K1细胞和中国仓鼠基因组相比，已经产生了25711个染色体结构多样性，包含13735个插入和11976个缺失［11］。在随后的细胞系建立及培养过程中，突变仍然在不断产生。CHO细胞可能的突变贯穿于长期传代过程中的每次细胞分裂，包括插入、缺失、点突变等序列变异以及染色体结构变异，足够量突变的积累可能产生染色体结构变异，导致染色体不平衡重排，致使CHO细胞染色体重排成为一种常见现象［12-13］。由于整个染色体的丢失或获得，这些染色体结构的变异还会被非整倍体补充，进而表现为染色体非整倍性和结构改变，因此成为永生细胞的特征性标志［14-15］。

由于上述原因，CHO细胞没有明确的染色体数目［16］。大量文献显示，CHO-S细胞具有和原始中国仓鼠细胞相似的染色体数目（22条），长期传代时染色体数目没有变化；CHO-DG44有20条染色体（19～21条染色体）；CHO-K1细胞在传代过程中染色体数目明显减少（18～20条染色体），CHOK1在有谷氨酰胺培养基长期传代情况下，染色体数目下降到19条，而在无谷氨酰胺的培养基中长期传代，染色体数下降到18条［17-20］。但随着培养时间的推移，细胞株染色体数目没有再发生明显变化。因此，虽然每个细胞株都有其特征性的染色体数，但细胞群体内染色体数的变化是随机发生且不可预测的，发生机制还未彻底揭示［21］。其原因可能是，细胞在体外人工高氧、富营养的培养条件下，快速分裂、增殖，积累大量突变造成染色体变异。另外，CHO细胞有较多的端粒序列重复，序列相似性增加了染色体易位发生的可能性。随着培养时间的增加，这些变异会随机积累，从而产生较大的染色体突变［22-25］。

CHO细胞在染色体突变过程中，有些染色体相对保守，围绕这些相对保守染色体的研究对于细胞转染及获得稳定克隆具有重要意义［26］。不同的培养基和传代过程会导致观察到的未变异染色体不完全相同。CHO-DG44细胞所有染色体中有5条或者7条是正常染色体，包括Chr1的2个拷贝，以及Chr2、Chr4、Chr5、Chr8和Chr9的1个拷贝，且Chr4存在染色体缺失或延长情况。在CHO-K1细胞的所有染色体中，有8条左右是正常的，包括Chr1和Chr5的2个拷贝，Chr2、Chr3、Chr8和Chr9的1个拷贝，其他染色体均发生重排。综上所述，CHO-K1和CHO DG44相对保守的染色体，包括Chr1、Chr2、Chr8和Chr9［26-27］。这些保守的染色体可以作为定点整合或随机整合的理想靶点［28-30］。

2 CHO细胞不同亚型生长状态和表达差异性

CHO细胞常见的几种亚型中，CHO-S被公认为是比生长速度（specific growth rate）最高的细胞，具有最短的倍增时间［31］。有研究发现，CHOK1、CHO-DG44和CHO-S 3种宿主细胞的倍增时间分别为24±2、27±2和18±2 h［32］。本团队培养的宿主细胞CHO-K1、CHO-DG44（使用CD CHO培养基）倍增时间分别为19.49±0.38和17.80±0.97 h，与Xu等［31］报道的培养倍增时间不同，这可能是相同亚型宿主细胞在不同实验室长期传代积累发生突变造成的差异，也可能是培养条件引起的。

有研究发现，CHO-S细胞中糖酵解及三羧酸循环中重要的酶类蛋白、与细胞生长相关蛋白（如肌球蛋白）和细胞周期依赖性激酶表达水平较高。其中，肌球蛋白可能和细胞分裂、细胞运动、细胞形态维持等有关，细胞周期依赖性激酶与细胞周期、转录、mRNA加工有关，同时CHO-S细胞具有最高的葡萄糖消耗速率，以上结果可能是CHO-S细胞生长速度快的原因［32-33］。而CHO-DG44细胞中与细胞生长相关蛋白表达水平及葡萄糖消耗速率相对较低可能导致了CHO-DG44的生长速度最慢。在长期培养过程中，持续的培养一般会使细胞生长速率增加，但是细胞生长速率增加现象是随机出现的，说明染色体突变是随机的。

转入目的基因后，比生长速率最快的依然是CHO-S细胞。CHO-K1、CHO-DG44和CHO-S 3种宿主细胞转染携带相同目的基因的相同质粒，单克隆通过不同的方式培养，无论是批式培养（batch culture）、批式补料培养（fed-batch culture），还是灌注培养（perfusion cultuer），CHO-S细胞都有最快的比生长速率，并能最快到达最高密度。而所有培养方式中，CHO-K1细胞比生长速率最慢；在最高密度方面，批式培养获得的CHO-S细胞和CHO-DG44细胞比CHO-K1细胞有更高的密度；批式补料培养和灌注培养中，CHO-DG44细胞密度最高，CHO-K1最高密度相对最低［10，34］。基因组学研究表明，CHO细胞为了适应无血清条件下的高密度生长，其促细胞凋亡基因的表达比中国仓鼠细胞明显下降，抗凋亡基因表达明显上升［11］。除基因表达水平外，凋亡相关基因拷贝数的改变也可以影响细胞生长，CHO细胞亦不例外［11，35］。

CHO-K1、CHO-DG44和CHO-S 3种宿主细胞在抗体表达和密度方面的表现是相反的，与宿主细胞相比，不同培养基对于抗体比生长速率的影响较小。在批式补料培养中，抗体比生产率由高到低依次是：CHO-K1细胞、CHO-DG44细胞、CHO-S细胞，其中CHO-K1细胞的抗体比生产速率是DG44细胞的2～3倍，是CHO-S细胞的6～8倍，且补料并没有给CHO-S细胞带来很大的表达提升［34］。因此，CHO-K1细胞作为工程细胞表达抗体，具有低密度、高表达的特点。

研究表明，CHO-DG44细胞在转录速率方面可能存在瓶颈，其与转录及糖酵解过程相关的蛋白表达水平均次于CHO-K1。蛋白质组学研究发现，CHO-K1细胞中与转录相关的几种蛋白表达水平较高，如核糖核苷二磷酸还原酶、核仁素蛋白、核仁素相关蛋白NRP等［32］。同时，CHO-K1细胞有更大的内质网，更丰富的线粒体基因组变异和异质性以及与之对应的高细胞特异性抗体表达量［36］。内质网对于分泌蛋白的折叠组装非常关键，如果内质网里不可逆地错误折叠蛋白超过一定限度，细胞将启动未折叠蛋白响应机制，最终发生细胞凋亡。因此，大内质网有利于分泌蛋白的高产率，也有利于高产细胞的存活和蛋白加工。丰富的线粒体基质有利于细胞自我供能，便于内质网加工处理未折叠的蛋白［37-39］。由于内质网和线粒体占据了细胞内大量的空间，因此抗体表达量也反映在细胞体积上。研究发现，灌流培养时高产的CHO-K1细胞直径15.7±0.7 μm，CHO-DG44细胞直径14.2±0.5 μm，CHO-S细胞直径13.7±1.1 μm［34，40］。

热稳定性的增加可提高抗体表达水平，而热稳定性与宿主细胞有关［41-42］。研究表明，CHODG44和CHO-K1表达抗体热稳定性接近，均明显高于CHO-S表达抗体热稳定性［34］。然而，热稳定性差异影响蛋白质表达的机制尚未明确，IgG1链间二硫键附近LC端丝氨酸的有无可能是影响抗体稳定性的原因之一［43］。

3 CHO细胞不同亚型的糖型差异

抗体糖基化位点的组成主要是G0F、G1F、G2F，偶尔会有1个或2个唾液酸残基，甘露糖基化、岩藻糖基化和无糖基化，这些受培养基影响较小，主要受细胞株影响［44］。CHO-DG44细胞表达单克隆抗体，相对于CHO-K1细胞和CHO-S细胞表达的抗体甘露糖基化程度高（CHO-S：2%～3%；CHO-K1：5%～9%；CHO-DG44：11%～13%）；抗体产物岩藻糖基化在CHO-S细胞中最高（94%～96%），其次是CHO-K1细胞（82%～84%）和CHODG44细胞（71%～83%）；抗体无糖基化修饰在CHO-K1细胞（2%～5%）和CHO-S细胞（1%）中含量较低，且在CHO-DG44培养物中未检测到［34-45］。

半乳糖基化很大程度上受培养基影响，比如培养基里的尿苷、氯化锰和半乳糖等成分，但同时细胞株对其也有一定程度影响［46-47］。CHO-K1细胞相对于CHO-DG44细胞和CHO-S细胞可以达到较高的抗体半乳糖基化水平，而CHO-S细胞半乳糖基化水平最低。唾液酸化水平较高的是CHOK1细胞（21%～36%），其次是CHO-DG44（15%～19%）和CHO-S细胞（6%～15%），原因可能是唾液酸形成相关酶类在CHO-K1中表达水平较高，如ST3GAL1、ST3GAL 2、ST3GAL 5、ST3GAL 6等［34，48］。

不同宿主细胞存在糖基化之间的差异［49］。CHO-K1细胞虽然仅有3个糖型相关酶且与人类没有同源性，糖型修饰与人类仍具有一定的差别，如CHO基因组中N-乙酰葡萄糖胺相关酶类基因不会全部表达，因此CHO细胞不会生产含有二等分N-乙酰葡萄糖胺残基的糖型蛋白；另一方面，CHO细胞基因组相对简单，因此容易进行基因修饰，如仅通过敲除岩藻糖转移酶8（fucosyltransferase 8，FUT8）基因即可去除蛋白的N-糖岩藻糖修饰，从而增加抗体ADCC效应，原因在于CHO-K1细胞岩藻糖转移酶中仅有该基因表达［11，50-52］。CHODG44和CHO-S细胞来源于CHO-K1，在此基础上，糖型结构又发生了一些变化。

有研究发现，中国仓鼠有256种酶，CHO-K1细胞、CHO-DG44细胞和CHO-S细胞分别至少突变13%、2%、25%，虽然不是所有的突变都影响酶活或者存在底物偏好，但在漫长的糖型演化过程中，这些突变增加了最终糖型变化的可能性［11，34］。这就是不同的CHO表达系统会产生不同糖型的原因。

4 展望

在构建不同CHO细胞系的过程中，基因乃至染色体已经发生了明显变化，这些改变进一步影响了不同细胞系的代谢和生长方式。CHO-S细胞染色体数目和原始中国仓鼠细胞相似，但是CHOS细胞中糖酵解和三羧酸循环中重要酶类的高水平表达表现为CHO-S产生最高的葡萄糖消耗速率，从而使得CHO-S细胞表现出较快的生长速率；Dhfr基因的敲除可能导致该细胞系细胞周期相关蛋白表达量下降，从而导致CHO-DG44生长较慢；CHO-K1数目可能较少，但含有丰富的能量代谢关键物质，因此生长较快［27，31，48］。

除细胞系的建立过程外，长期传代和培养过程中，CHO细胞也会持续积累变异，甚至造成染色体结构变异，并且这些变异具有随机性，是不可预测和不可控的［12］。内在遗传不稳定性是CHO的蛋白表达可能出现不稳定性的因素之一，持续变异是否影响产品质量，需持续关注并展开相关研究。除保证细胞系的单克隆源性及稳健的控制策略外，CHO细胞中存在的相对保守的DNA序列使得目的基因定点整合到保守基因序列成为一个较好的选择［12，53-55］。但是目前大部分项目都是使用相对成熟的随机整合方式，整合位点所在区域如果不是保守区域，则需要评估基因突变以及染色体变异与重组蛋白表达的稳定性之间有无直接的相关性。无论定点整合还是随机整合，均需进行细胞株稳定性实验以证明重组细胞不同代次表达产品质量的一致性。

除不同培养基和培养方式外，细胞系本身也可以影响抗体表达量及质量。CHO-K1细胞有利于抗体表达，CHO-S有利于细胞量积累，而CHODG44表达能力和细胞生长表现居中［34］。高培养密度会带来高耗氧，高消耗营养物质，从而给培养过程带来压力，因此从便于培养和提高目的产物积累效率角度来看，CHO-K1细胞的表现最优秀，具有高抗体比生产率、高表达和低细胞密度的特点［34，56-57］。同时，CHO-K1的低密度特点给工艺和培养基开发留出了更大的可操作空间，比如在CHO-K1细胞低密度基础上进行培养基和培养工艺开发，以便于带来更大的抗体收获量。

不同宿主细胞由于遗传背景不同会影响抗体产量和质量，因此宿主细胞选型需要结合目的蛋白预期的质量属性。糖型也可能影响生物药物的药效，因此需要将生物药的安全性、有效性和糖型结果关联，进而指导宿主细胞选择［58］。糖型本身也可能影响抗体电荷异质性，CHO细胞系建立过程中产生了大量基因变异，这些变异可能影响目的蛋白翻译后修饰，因此宿主细胞可能通过多种方式对抗体电荷异质性产生影响，但具体机制仍需要进一步研究［59］。