内生菌对镉胁迫蚕豆根尖细胞毒理效应的影响

马莲菊, 赵海彤, 任苓姝, 刘伊凝, 王 泽

(沈阳师范大学 生命科学学院, 沈阳 110034)

随着工业的发展,重金属污染越来越严重。镉(Cd)是农业生产中的主要污染重金属,其毒性仅次于汞。镉不是植物生长的必需元素,过量的镉对植物有很大毒害作用[1]。近年来,国内外学者关于镉对植物生理生化影响方面的研究有很多,但从遗传毒理方面所做的研究较少。

蚕豆是一种广泛种植的经济作物,是进行遗传学及毒理学研究的理想材料[2]。1982年由Francesca等[3]建立的蚕豆根尖细胞微核技术深受人们重视,在细胞遗传毒性检测中得到了广泛应用。

植物内生菌作为一种新的微生物资源,在农业上极具应用潜力。内生菌是植物微生态系统中的重要组成成分,能提高农作物的生长发育,增强农作物的抗重金属、抗盐碱、耐干旱、耐寒和抗病虫害发生能力等,进而提高宿主植物对环境的适应性,从而保持植物生态系统的稳定[4]。

在前期的研究中,课题组从野大豆中分离纯化出一株内生菌YD25,发现其具有吸附重金属的作用。因此,选用内生菌YD25侵染蚕豆根尖,研究其对Cd胁迫蚕豆根尖细胞遗传毒理的影响效应,以期探明内生菌对植物根尖细胞的诱抗活性,为内生菌的研究开发与应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试材料为日本青蚕豆种子;内生菌YD25由沈阳师范大学微生物遗传实验室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 内生菌培养

将保存于PDA固体培养基中的内生菌YD25转接到PDA液体培养基中,并在24 ℃和120 rpm的恒温摇床中培养,10 d后待用。

1.2.2 蚕豆培养及处理

在盛有蒸馏水的烧杯中放入洗干净的蚕豆种子,然后将其置于25 ℃的温箱内浸泡12～24 h,此期间换水次数至少2次。将吸涨后的种子放入铺有薄层湿润脱脂棉的平皿内,温箱温度调节为25 ℃,将平皿放入其中,催芽36～48 h,期间换水2～3次至大部分种子初生根长为1～2 cm。

将已完成催芽的蚕豆种子分为2组,侵染组(E+)将30 mL 1%菌悬液加入蚕豆种子培养液中,进行内生菌侵染;未侵染组(E-)则不加入菌悬液,直接加入等量蒸馏水培养。2组同时用不同浓度CdCl2溶液(0, 4和8 mg·L-1)处理8 h,再进行镉胁迫处理,共6组,然后将处理好的种子用蒸馏水浸洗3次,每次2～3 min,洗净后在25 ℃下恢复培养22～24 h。

恢复培养后,在根尖细胞分裂高峰期,切取1 cm左右根尖,使用Carnoy固定液固定2～24 h。

1.3 测定方法

1.3.1 解离

用蒸馏水浸洗固定好的根尖2次,每次5 min,吸净蒸馏水。用1 M HCl在60 ℃下解离11 min左右,再用冷1 M HCl洗1次。吸去HCl,用蒸馏水浸没根尖3次,每次1～2 min。

1.3.2 染色

在10 ℃左右的黑暗条件下,用Schiff试剂染色1 h。

1.3.3 漂洗

用漂洗液漂洗3次,每次3～5 min。

1.3.4 水洗、压片、镜检

水洗5～10 min,滴一滴45%醋酸压片。将制片置于低倍镜下找到分生组织区中细胞分散均匀和分裂相较多的部位,再转换到高倍镜下观察。每组观察根尖数为10个,每个根尖约1 000个细胞。

1.4 统计分析

进行根尖细胞微核千分率(MCN‰)、抑制率(%)、有丝分裂指数及染色体畸变率测定。

2 结果与分析

2.1 内生菌对镉胁迫下蚕豆根尖细胞微核的影响

由表1可见,在无镉胁迫下,阴性对照微核率最低(5.92±0.35‰),内生菌侵染后微核率明显降低,抑制率达到21.11%;在镉胁迫下,随着镉溶液浓度的增加,E-组与E+组的蚕豆根尖细胞微核率均增大,微核率与镉溶液浓度之间表现为明显的正相关。内生菌对微核的产生表现出明显的抑制作用,抑制率达到20%以上,但随着镉溶液浓度上升,抑制率呈现下降趋势,说明高浓度的镉对内生菌作用有一定阻碍;在镉溶液浓度相同的情况下,E+组蚕豆根尖细胞微核率均明显低于E-组(p<0.01或p<0.05)。

表1 内生菌对镉胁迫下蚕豆根尖细胞微核率、有丝分裂指数、染色体畸变率的影响

2.2 内生菌对镉胁迫下蚕豆根尖细胞有丝分裂指数的影响

在无镉胁迫下,E+和E-组相比,E+的有丝分裂指数明显更高,且差异显著(p<0.05);在镉胁迫条件下,蚕豆根尖细胞有丝分裂指数随镉溶液浓度增加而呈下降趋势,具有浓度效应。在同样浓度的镉胁迫下,蚕豆根尖经内生菌侵染处理后有丝分裂指数明显升高(表1)。由此说明,内生菌对蚕豆根尖细胞有丝分裂存在着显著的促进作用。

2.3 内生菌对镉胁迫下蚕豆根尖细胞染色体畸变率的影响

由表1可见,镉胁迫的根尖细胞染色体畸变率均大于未加镉培养的根尖,说明镉胁迫导致蚕豆根尖细胞有丝分裂过程中染色体发生畸变。内生菌具有显著的降低蚕豆根尖细胞染色体畸变的功能。在无镉胁迫下,E+组蚕豆根尖细胞染色体畸变率明显低于E-组(p<0.05)。在同浓度的镉溶液处理时,E+组较E-组的染色体畸变率明显降低。

3 讨 论

3.1 内生菌对镉胁迫下蚕豆根尖细胞有丝分裂的影响

重金属对蚕豆根尖细胞分裂的抑制作用主要体现在延长分裂间期使分化的细胞数量下降[5]。当植物抵抗重金属胁迫时,代谢系统被激活,加速了重金属离子的进入,使植物的代谢活动受到抑制,从而对植物产生了毒害作用[6]。在重金属离子浓度高时,毒害作用超过了植物自身的保护作用,核酸酶活性降低,使DNA合成速率减慢,分裂间期延长,或与DNA结合,造成DNA的交联,阻碍DNA复制的顺利进行[7]。本研究发现,在一定的浓度范围内,有丝分裂指数随镉离子浓度升高而逐渐降低,表明镉缩短了细胞分裂期,延长了细胞分裂间期。内生菌对促进蚕豆根尖细胞分裂具有显著作用,同时能有效地削弱镉对蚕豆根尖的毒害作用。这表明内生菌可以诱导蚕豆根尖细胞周期发生变化,即缩短细胞分裂间期,促进细胞进入分裂态。有学者指出,内生菌具有合适的降解途径或重金属整合系统,能够提高宿主植物对重金属的耐受能力,从而有助于宿主植物在重金属胁迫条件下生存[8]。

3.2 内生菌对镉胁迫下蚕豆根尖细胞染色体畸变的影响

染色体畸变是微核形成的主要原因。染色体或染色单体断裂会导致染色体或染色单体缺失,或者引起各种重排,从而出现染色体结构异常。镉直接作用于DNA使DNA和蛋白质的合成及RNA转录受到干扰,使与染色体运动有关的物质(如纺锤体蛋白等)不能合成,或合成减少,造成染色体损伤后不能正常修复[9]。在本研究中,镉胁迫作用于蚕豆根尖,导致不同程度的染色体畸变,染色体的畸变率与镉的浓度呈正相关。被镉染毒处理后的蚕豆根尖细胞内存在着多种染色体畸变类型,如染色体断片、染色体滞后、染色体桥、多极分裂等。有研究指出,内生菌能够提高植物对非生物胁迫的抗逆性,具有很强的耐重金属性能[10-11]。通过本研究的数据也可以证明这一点,E+组染色体畸变率明显低于E-组。

3.3 内生菌对镉胁迫下蚕豆幼苗根尖细胞微核的影响

微核是指位于细胞质中完全与主核分开的圆形或椭圆形的小核[12]。微核产生与具有损坏性质的理化因子的作用有关, 这些因子使染色体发生断裂,成为断片,断片不能进入子细胞而形成微核。因此, 微核率的高低可反映遗传损伤的程度[13]。目前, 微核检测技术已成为评价包括重金属在内的环境污染物毒性的有效方法[14]。本研究结果表明,蚕豆根尖细胞微核率随镉浓度的增加而增加,且与染色体畸变率呈正相关。施加内生菌YD25后能有效地减少染色体畸变的产生,从而抑制蚕豆根尖细胞中微核的形成。因此,内生菌YD25可用来缓解镉毒害,促进作物生长。

致谢感谢沈阳师范大学大学生创新创业训练计划资助项目(X202210166078X)的支持。