金荞不同器官提取物对几种杂草种子萌发的影响及其安全性研究

2023-10-13欧阳屹南刘洋沈伦豪任奎赵辉唐新科周美亮

作物杂志 2023年4期

欧阳屹南刘洋沈伦豪任奎赵辉唐新科周美亮

（1 湖南科技大学生命科学与健康学院，411201，湖南湘潭；2 中国农业科学院作物科学研究所，100081，北京；3 西南大学农业与生物科技学院，400715，重庆）

田间杂草防治一直是我国农业生产中十分关键的环节。我国1400 余种杂草中具有严重危害性的有130 余种，在杂草防治年投入235 亿元的情况下，因杂草而造成的作物减产仍然高达5000万t[1]。目前，我国农田杂草防控方式主要为人工除草和化学除草，前者效率低，不利于农业产业化发展，而后者会造成严重的环境污染[2]。相比之下，生物除草具有高效低毒和安全可靠的特点，且能够实现可持续发展，符合人与自然和谐发展的理念，在未来农业发展中将占据重要地位[3]。

化感作用是植物产生和释放的防御性代谢产物（化感物质）对同种或异种植物产生负面影响的一种干扰机制。植物化感物质主要为次生代谢物，其成分复杂且存在一物多效和一效多物现象。化感作用作为植物适应环境的一种机制，作用温和却行之有效，并具有一定的特异性，不同的植物具有不同甚至相反的化感作用[4]。植物化感作用的研究一直是生物除草极为关键的环节。

在农业生产实践中，研究发现，荞麦对某些杂草具有一定的抑制作用，不管是轮作、间作[5-6]还是化感防治[7-8]等都表现出较好的效果，目前荞麦杂草防控技术越来越成熟，应用也越来越广泛。其中，金荞（Fagopyrumcymosum）表现出明显的抑草作用，可能主要来源于其发达的根系、快速的生长、宽广的空间占比和化感物质分泌[9]。

金荞是蓼科（Polygonaceae）荞麦属（FagopyrumMill.）多年生双子叶草本植物，是荞麦属中主要的野生种[10]。金荞作为药食两用作物[11]，在中国及其他国家均具有悠久的种植历史[12]。金荞生药及化学成分主要为一类原花色素苷类缩合型单宁混合物，还含有鞣质类、黄酮类、苷类、甾体类、萜类、挥发油类和有机物类化合物等[13-14]。与大多数植物类似，金荞分泌的化感物质大多为亲脂性[4]。为全面探究金荞化感物质对杂草的抑制效果，本研究选取低毒有机溶剂提取金荞的活性物质，采用MS 培养基法和滤纸法比较研究了金荞根、茎、叶3 个器官的化感物质对3 种杂草种子萌发的影响，并对其安全性进行评估[2]，为荞麦杂草防控技术在农业生产中的应用提供理论依据和科学指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试草本植物种子为拟南芥（Arabidopsis thaliana）、黑麦草（Loliumperenne）、羊茅（Festuca ovina）和波斯菊（Cosmosbipinnata）[15]，均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。供试作物种子为金荞、甜荞（Fagopyrumesculentum）、苦荞（Fagopyrumtataricum）、燕麦（Avenasativa）、小麦（Triticumaestivum）和大麦（Hordeumvulgare），均由中国农业科学院作物科学研究所提供。

1.2 金荞提取物的制备

取金荞新鲜根、茎、叶洗净，烘箱65℃处理4～5h 至恒重，使用粉碎机粉碎，过40 目筛。称取1g 粉末，以1g:30mL 的料液比混合粉末和提取剂（蒸馏水，或75%乙醇，或75%甲醇），用50℃超声波处理30min，4 层纱布过滤取滤液（或8000转/min 离心5～10min 后取上清液，根据不同部位提取物适当调整离心条件），用0.22μm 滤膜抽滤，即为荞麦提取物原液。用蒸馏水将不同种类和体积的原液定容至一定体积制成后续所需的稀释液，并用0.22μm 针筒过滤除菌，密封避光保存备用[16]。

1.3 种子处理

1.3.1 种子灭菌拟南芥：取1/4 体积种子于2mL离心管中，加入2mL 75%乙醇持续上下颠倒10min后倒掉液体，加入2mL 无水乙醇上下颠倒灭菌10min，晾置数小时至完全干燥。苦荞、甜荞和杂草种子：取1/4 体积种子于50mL 离心管中，加入50mL 10%NaClO 持续上下颠倒7min 后倒掉液体，加入50mL 75%乙醇持续上下颠倒灭菌5min 后倒掉液体，加入50mL 无菌水上下颠倒洗刷数次，重复用无菌水洗刷5～6 次，倒掉液体，晾置数小时至完全干燥。燕麦、小麦和大麦种子：取1/4 体积种子于50mL 离心管中，加入1%H2O250mL 摇匀后4℃冰箱静置过夜，在无菌超净台中用无菌水洗5～6次，倒掉液体，晾置数小时至完全干燥，以上均严格遵守无菌操作。

1.3.2 制备MS 固体培养基 MS 培养基（1L）：称取4.43g MS 粉末（Murashige skoeg Basal Medium with Vitamin）和30g蔗糖，溶解定容至1L，用5mol/L NaOH 溶液调节pH 至5.8～6.2，加入植物凝胶2.7g，高压蒸汽灭菌。含稀释液的MS 培养基（1L）：定容900mL，在无菌超净台中分别将25%、50%和100%的无菌稀释液以1:9 的比例混合制成不同终浓度的培养基，每个培养皿倒入25mL 培养基，凝固后避光常温放置。

1.3.3 提取和处理方法如表1 所示，为获取合理的提取和处理方法，选取水（对照，CK）、75%乙醇及75%甲醇为溶剂，利用超声波提取根、茎、叶的等比粉末，得到提取物，并分别以3 种溶剂和提取物为稀释液，拟南芥为受试植物，观察不同溶剂和浓度的金荞提取物对拟南芥萌发的影响[16]。

表1 不同溶剂及浓度的金荞提取物处理Table 1 Treatments of F.cymosum extract with different solvents and concentration

1.3.4 种子培养每板50 粒拟南芥种子均匀播种至培养基中。杂草种子和作物种子均采用滤纸萌发的方法，每个培养皿铺3 层灭菌滤纸，加入6mL稀释液，其中杂草种子播种30 粒，作物种子播种20 粒。所有种子播种后均在4℃冰箱中放置48h，之后置于28℃恒温培养室黑暗培养7d，计算每天的萌发率（germination rate），3d 时计算种子的发芽指数及化感效应指数，7d 时计算种子的发芽率（germination percentage，GP）等指标。

计算公式如下，萌发率（%）=（第t天发芽种子数/受试种子数）×100；GP（%）=（第7 天发芽种子数/受试种子数）×100；发芽指数（germination index，GI）=∑(Gt/Dt)；化感效应指数（response index，RI）=1–(C/T)，（T≥C）或RI=(T/C)–1，（T

1.4 数据处理

利用Microsoft Excel Office 16 作图，用Origin 2021 进行方差分析和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 对拟南芥种子萌发的影响

如图1 和表2 所示，2.5%、5%、10%的乙醇溶剂和10%的甲醇溶剂能完全抑制拟南芥种子萌发，发芽率均为0.00%。3 种浓度下水提物处理的拟南芥种子萌发趋势为随浓度的升高而降低，在1～4d存在显著性差异，萌发化感效应指数分别为0.58、0.13 和-0.49，但5～7d 的生长曲线和发芽率与CK基本一致，说明金荞水提物在拟南芥萌发初期有明显的化感作用，且呈现“低促高抑”的现象。甲醇提取物相较于甲醇对拟南芥种子萌发的抑制作用更明显，2.5%和5.0%甲醇提取物的化感效应指数分别为-0.78 和-1.00，比较两者的萌发曲线和生长状况（图1）可知，5.0%甲醇提取物对拟南芥种子萌发的抑制作用高于2.5%浓度。同时，鉴于荞麦中绝大多数作用于植物的鞣质类、黄酮类和苷类等化感物质均难溶于水[14]，选取75%甲醇为溶剂，5.0%为稀释液浓度为后续金荞不同器官提取物的作用条件。

图1 不同金荞提取物处理7d 后拟南芥种子的萌发情况Fig.1 Germination of A.thaliana seeds treated with different F.cymosum extracts for seven days

表2 不同溶剂及浓度的金荞提取物对拟南芥种子萌发的影响Table 2 Effects of F.cymosum extracts with different solvents and concentrations on seed germination of A.thaliana

2.2 对杂草种子萌发的影响

2.2.1 对黑麦草种子萌发的影响如表3 和图2 所示，水、甲醇溶液和根提取物处理的种子7d 萌发率曲线没有显著差异，茎和叶的甲醇提取物在种子萌发第1 天呈现明显的抑制作用。其中茎甲醇提取物的萌发化感效应指数与CK 有显著性差异。说明5.0%金荞茎甲醇提取物可明显抑制黑麦草种子初期的萌发。

图2 不同金荞提取物处理7d 后3 种草本植物种子的萌发情况Fig.2 Germination of seeds of three herbaceous plants treated with different buckwheat extracts for seven days

表3 金荞不同器官甲醇提取物对黑麦草种子萌发的影响Table 3 Effects of methanol extract from different organs of F.cymosum on seed germination of L.perenne

2.2.2 对羊茅种子萌发的影响如表4 和图2 所示，5 组处理的羊茅种子1～4d 萌发率曲线没有显著性差异，金荞根、茎、叶提取物处理均呈负向的化感作用，化感效应指数分别为-0.43、-0.33 和-0.39。但7d 的萌发率曲线中，金荞提取物的化感效应在5～7d 对羊茅种子萌发的影响最大，且茎提取物处理在第5 天相较于CK 有明显的抑制作用。

表4 金荞不同器官甲醇提取物对羊茅种子萌发的影响Table 4 Effects of methanol extracts from different organs of F.cymosum on seed germination of F.ovina

2.2.3 对波斯菊种子萌发的影响如表5 和图2 所示，相较于CK，甲醇和金荞根、茎、叶甲醇提取物处理的波斯菊种子7d 的萌发率没有显著性差异，发芽率和发芽指数同样没有明显变化。说明金荞提取物对波斯菊种子萌发没有明显的化感作用。

表5 金荞不同器官甲醇提取物对波斯菊种子萌发的影响Table 5 Effects of methanol extracts from different organs of F.cymosum on seed germination of C.bipinnata

2.3 对作物种子发芽的安全性分析

2.3.1 对甜荞种子萌发的影响如图3 和表6 所示，相较于CK，甲醇和3 种金荞提取物处理下甜荞种子7d 的萌发率和发芽指数均无显著性差异。其中茎提取物处理的种子发芽指数偏低，与叶提取物处理呈现显著性差异，但与CK 没有明显差异。故种植甜荞时可以使用低浓度的金荞甲醇提取物研制除草剂。根据化感效应指数，使用的优先级为叶提取物（0.18）＞根提取物（-0.13）＞茎提取物（-0.40）。

图3 金荞不同器官甲醇提取物处理7d 后5 种作物种子萌发情况Fig.3 Seed germination of five crops after seven days of treatment with methanol extracts from different F.cymosum organs

表6 金荞不同器官甲醇提取物对甜荞种子萌发的影响Table 6 Effects of methanol extracts from different organs of F.cymosum on seed germination of F.esculentum

2.3.2 对苦荞种子萌发的影响如图3 和表7 所示，5 个处理对苦荞种子萌发均无明显抑制作用，其中叶提取物在第1 天呈现显著的促进作用，但随着萌发的进行萌发率差异逐渐消失。从萌发曲线、发芽率和发芽势的对比来看，金荞根、茎、叶的提取物在5%浓度下对苦荞种子萌发均没有抑制作用，故种植苦荞时可以使用低浓度金荞的根、茎、叶甲醇提取物研制除草剂。根据化感效应指数，使用的优先级为叶提取物（0.37）＞根提取物（0.02）＞茎提取物（0.00）。

表7 金荞不同器官甲醇提取物对苦荞种子萌发的影响Table 7 Effects of methanol extract from different organs of F.cymosum on seed germination of F.tataricum

2.3.3 对燕麦种子萌发的影响如图3 和表8 所示，5 个处理的燕麦种子萌发情况均基本一致，1～3d的萌发率、发芽率和发芽指数均无显著性差异，说明金荞的根、茎、叶甲醇提取物在5.0%浓度下对燕麦种子发芽没有明显的抑制作用，在种植燕麦时均可用于研制除草剂。根据化感效应指数，使用的优先级为茎提取物（0.05）＞根提取物（0.04）＞叶提取物（-0.11）。

表8 金荞不同器官甲醇提取物对燕麦种子萌发的影响Table 8 Effects of methanol extract from different organs of F.cymosum on seed germination of A.sativa

2.3.4 对小麦种子萌发的影响如图3 和表9 所示，5 个处理的小麦种子萌发情况基本一致，1～3d萌发率、发芽率和发芽指数均无显著性差异，说明金荞的根、茎、叶甲醇提取物在5.0%的浓度下对燕麦种子发芽没有明显的抑制作用，在种植燕麦时均可以用于研制除草剂。根据化感效应指数，使用的优先级为根提取物（-0.06）＞叶提取物（-0.18）＞茎提取物（-0.22）。

表9 金荞不同器官甲醇提取物对小麦种子萌发的影响Table 9 Effects of methanol extract from different organs of F.cymosum on seed germination of T.aestivum

2.3.5 对大麦种子萌发的影响如图3 和表10 所示，5 个处理的大麦种子1～3d 萌发率、发芽率和发芽指数均无显著差异。茎和叶提取物处理的大麦种子1 和2d 萌发率和发芽指数则明显低于CK，其中叶提取物明显降低了大麦种子的发芽率，说明金荞茎和叶的甲醇提取物对大麦种子的萌发有十分明显的抑制作用。

表10 金荞不同器官甲醇提取物对大麦种子萌发的影响Table 10 Effects of methanol extract from different organs of F.cymosum on seed germination of H.vulgare

3 讨论

化感作用是植物与其他物种之间产生次生物质相互影响的一种现象[18]，产生化感作用的次生物质被称为化感物质[19]。许多研究指出，苦荞秸秆还田具有良好的杂草抑制效应及增产效应[6,9,20]，与此同时，荞麦化感物质对许多杂草有明显的抑制作用[21]，对金荞提取物的抑草机制研究较少。金荞生药及化学成分主要为一类原花色素苷类缩合型单宁混合物[13-14]，与苦荞抑制杂草的化感物质十分相似[22-25]。大多数脂溶性溶剂对植物具有一定的毒性，为了排除有机溶剂本身对杂草种子萌发的干扰，本研究以拟南芥为受试植物初步确定了金荞活性物质发挥化感作用的最佳条件，即75%甲醇为提取溶剂，5.0%为作用浓度，研究金荞有机溶剂提取物对黑麦草、羊茅和波斯菊3 种杂草种子萌发的影响。

植物不同器官中化感物质的种类和含量分布差异较大，研究化感物质在植物体中的分布对生物除草剂的开发和利用具有重要意义[26]。本研究提取了金荞根、茎、叶3 个器官的活性物质，探究它们对3 种杂草种子萌发趋势和发芽率的影响，发现提取物对单子叶杂草黑麦草和羊茅的种子萌发有明显抑制作用，能不同程度地改变其萌发曲线，降低萌发率，而对双子叶杂草波斯菊种子萌发的影响十分有限。据此推测，金荞化感物质可能对单子叶草本植物有抑制特异性。

除化感物质的影响外，植物间还存在生长空间和资源的竞争[16]。在对金荞抑草机制分析中同样需考虑化感物质和植物竞争的协同作用。本研究中，金荞3 种器官的甲醇提取物对杂草种子的抑制作用主要表现在萌发初期，但对种子培养7d 的发芽率影响不大。由此推测，金荞含有的化感物质虽然不能完全抑制杂草种子的萌发，但可能通过延缓杂草种子初期的萌发，帮助金荞在生长早期取得竞争优势，从而进一步抑制杂草生长。