基于白及多糖多孔载药微球的制备与质量评价*

2023-10-12东泳杉李伟泽

化学工程师 2023年9期

陈程，东泳杉，李伟泽，2，赵宁，马莉

（1.西安医学院药学院，陕西西安 710021；2.江苏微纳医药科技有限公司，江苏扬中 212218）

白及为传统外伤用药，具有收敛止血、生肌消肿之功效[1]。白及多糖（BSP）是从中药白及中提取分离得到水溶性高分子多糖，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗纤维化、止血、组织修复等药理活性[2，3]。近几年研究表明，BSP 具有功能缓释、局部滞留、自身降解、生物安全性高、无毒无刺激等特点，它已作为新型生物医药高分子载体材料被广泛应用[4-6]。对于创伤愈合而言，药物应尽量少进入全身系统，而附着于表皮以达到表皮缓释效果，微球可原位固定，避免粒子扩散、防止突释、延长病灶部位滞留，目前，该体系在创伤愈合治疗方面显示巨大的潜力。研究表明，黄连素（BBR）局部外用可显著促进糖尿病溃疡伤口愈合，主要机制[7-11]通过恢复TrxR1/JNK 信号通路，减少氧化损伤与细胞凋亡，从而恢复糖尿病溃疡伤口的氧化还原状态，促进表皮细胞增殖，加快糖尿病溃疡伤口的愈合。据此，我们以BSP 微球包埋BBR 构建用于糖尿病溃疡的多孔生物黏附性微球（BBR-BSPMs），并对其进行质量评价，以为糖尿病溃疡治疗提供一种新制剂。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

白及多糖（自制）；D（+）-无水葡萄糖标准品（批号：B21882-100mg 上海源叶生物科技公司）；黄连素（批号：SB1604 北京索莱宝科技有限公司）；其他试剂均为分析纯。

QUINTIX124-TCN 型电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；ZNCL-BS 型智能磁力搅拌器（河南爱博特特科技发展有限公司）；KH7200DB 型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；Cary60 型紫外可见分光光度计（美国Agilent 公司）；CKX31SF 型倒置显微镜（Olympus）；ZEN3600 型Malvern 纳米粒度和ZETA 电位仪（英国马尔文仪器有限公司）；DZF6050 型真空干燥箱（温州顶历医疗器械有限公司）；T27 型布鲁克红外光谱仪（德国bruker 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 BSP-Ms 的制备在前期查阅文献的基础上，以微球得率和粒径为评价指标，分别考察BBR投料量、BSP 浓度、交联温度、交联体积分数、交联时间和搅拌速度等因素对实验结果的影响，初步得到BSP-Ms 的制备工艺参数。于50℃水浴条件下精密称定BSP 配得0.05g·mL-1水溶液作为水相，液体石蜡作为油相（水油相比为1∶5），于50℃、960r·min-1条件下将10%乳化剂（司盘-85∶吐温-80=2∶1，v/v）均匀分散于油相中；将BSP 水溶液用注射器缓慢滴加到油相中乳化成乳滴（130min），于冰箱4℃条件下冷藏30min，加11%交联剂（乙二胺∶环氧氯丙烷=1∶3），于40℃、960r·min-1条件下充分搅拌交联固化成球（70min）；将得到的微球乳液冷却、静置，用石油醚洗涤3 次除去油相，异丙醇、丙酮交替洗涤3～5次，60℃真空干燥箱干燥后，得BSP-Ms。

1.2.2 BBR-BSP-Ms 的制备按照12% BBR 投料量于水相中，参照“1.2.1”项下方法制备BBR-BSPMs。

1.2.3 BBR-BSP-Ms 外观性状、分散性观测取少量样品均匀分散，肉眼观察微球的颗粒性。再取少量样品于表面皿中，用蒸馏水分散，观察其是否均匀分散、有无粘连性。

1.2.4 BBR-BSP-Ms 形态和粒径大小、分布及电位评价采用光学显微镜观察其均匀性；采用扫描电镜（SEM）观察其外观形态和结构特征；采用倒置显微镜观察并标记区域内的微球粒径；采用Malvern激光粒度仪测定Zeta 电位。

1.2.5 BBR-BSP-Ms 红外光谱分析称取2mg 干燥BBR、BSP、BSP-Ms、BBR-BSP-Ms 和物理混合物，分别与KBr 粉末于红外灯下研细，混合均匀，进行压片处理，扫描得图谱。

1.2.6 BBR 含量测定配制系列浓度的BBR 对照品溶液，于350nm 处测吸光度，以吸光度A 为纵坐标，浓度C 为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.7 BBR-BSP-Ms 载药量和包封率的测定将干燥的BBR-BSP-Ms 置研钵中研细，精密称定10mg置于25mL 容量瓶中，加适量pH 值为7.4 的磷酸盐缓冲液超声15min 并定容至刻度，作为供试品溶液。以空白微球作参比，于350nm 处测定吸光度，通过BBR 标准曲线回归方程计算浓度，再按下式计算载药量和包封率。

式中 m:微球中药物量，mg；M:微球质量，mg；M0：药物投入量，mg。

1.2.8 BBR-BSP-Ms 体外释药性能研究[12]分别精密称取10mg BBR、BBR-壳聚糖（Cs）水凝胶（对照组）和BBR-BSP-Ms 置于透析袋中，加入5mL pH值7.4 的磷酸缓冲液，用封口夹扎紧透析袋，悬浮于装有100mL 相同释放介质的烧杯中，37℃、100r·min-1磁力搅拌器中水浴搅拌，于0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48h 定时取样5mL，每次取样后及时补足5mL 新鲜的释放介质。于350nm 波长处测定释放液的吸光度，计算BBR 浓度，按下列公式计算累积释放率。

微球第n 小时的药物累积释放率%=（Cn×100+∑Cn-1×5）/样品量×100%

2 结果与讨论

2.1 BBR-BSP-Ms 外观性状、分散性

BSP-Ms 呈浅白色粉末状，颗粒性较好；BBRBSP-Ms 呈浅黄色粉末状，颗粒性较好。取空白白及多糖微球和共载黄芪甲苷-黄连素白及微球适量于表面皿中，加入纯化水分散，微球可均匀分散，无粘连性。

2.2 BBR-BSP-Ms 形态和粒径大小、分布和电位图

由图1、2 可见，在光学显微镜下，BSP-Ms 与BBR-BSP-Ms 均可观察到大量微球且外形圆整，互不粘连。

图1 BSP-Ms 普通光学显微图（×100）Fig.1 General optical micrograph of BSP-Ms（×100）

图2 BBR-BSP-Ms 普通光学显微图（×100）Fig.2 General optical micrograph of BBR-BSP-Ms（×100）

由图3、4 可见，在倒置显微镜下，BSP-Ms 粒径大多处于60～70μm 之间、BBR-BSP-Ms 粒径均在20～30μm 之间，粒径分布均匀，形态圆整。

图3 BSP-Ms 倒置显微镜图Fig.3 Inverted microscope diagram of BSP-Ms

图4 BBR-BSP-Ms 倒置显微镜图Fig.4 Inverted microscope diagram of BBR-BSP-Ms

由图5 可见，采用SEM 观察所制备的BBRBSP-Ms，表面粗糙不平有褶皱，整体呈球状，圆整度较好，内部孔洞结构明显。

图5 BBR-BSP-Ms 扫描电镜图Fig.5 Scanning electron microscope image of BBR-BSP-Ms

由图6、7 可见，BSP-Ms 与BBR-BSP-Ms 电位经测定，均在-27.7mV 左右，表明稳定性良好。

图6 BSP-Ms 电位图Fig.6 Potential diagram of BSP-Ms

图7 BBR-BSP-Ms 电位图Fig.7 Potential diagram of BBR-BSP-Ms

2.3 BBR-BSP-Ms 布鲁克红外光谱分析

图8 为BBR、BSP、BSP-Ms、BBR-BSP-Ms 的红外光谱图。

图8 BBR、BSP、BSP-Ms、BBR-BSP-Ms 红外光谱Fig.8 Infrared spectrum of BBR、BSP、BSP-Ms、BBR-BSP-Ms

由图8 可见，BBR 粉末样品的光谱图中3344.06cm-1处的吸收峰为C-O 的倍频及芳环C-H振动峰，1505.66cm-1处的吸收峰为BBR 的芳环骨架振动峰，1272.71～1036.29cm-1为芳香脂肪醚的振动峰。

BSP 存在明显的特征吸收峰，3387.35cm-1处的吸收峰为O-H 的伸缩振动，2928.93cm-1处的吸收峰为-CH2-或-CH3中C-H 的伸缩振动，1637.55cm-1处的吸收峰为C-O 的不对称伸缩振动；1042cm-1和920cm-1处的吸收峰表示白及多糖的吡喃糖基化。

在BSP-Ms 的红外光谱中同时存在3267.33cm-1（O-H 的伸缩振动峰）、2924.50cm-1（C-H 的伸缩振动峰）、1637.16cm-1（C-O 的不对称伸缩振动峰）、1025.10cm-1和931.86cm-1等特征吸收峰，与BSP 二者图谱基本一致，表明BSP-Ms 中确实有BSP 的存在。

在BBR-BSP-Ms 红外光谱图中，3267.27cm-1处吸收峰与BSP-Ms 中3267.33cm-1处基本重合，2924.53cm-1、1025.97cm-1处的吸收峰与BSP 样品中2928.93cm-1、1025.10cm-1处吸收峰基本一致，证实BSP 的存在，1510.22cm-1处的吸收峰与BBR 中1505.66cm-1处吸收峰基本重合，BBR 含量主要由1510cm-1附近吸收峰的峰形和峰强决定，此处的吸收峰为BBR 的芳环骨架振动峰，峰越强，峰形越细长，则混合物中BBR 的含量越高。

2.4 BBR-BSP-Ms 包封率和载药量

以吸光度A 对BBR 浓度C 进行线性回归，得标准曲线方程Y=0.056X-0.0231（R2=0.9995），结果表明，BBR 在4～14μg·mL-1浓度范围内与其吸光度有良好的线性关系。经测定计算得出，该方法回收率为96.99～101.22%，精密度、稳定性和重复性实验RSD 均小于1.69%。分别对3 批BBR-BSP-Ms（每批5g）进行测定，包封率为（86.92±0.03）%，载药量为（19.78±0.08）%，BBR-BSP-Ms 质量可控，载药性能较好，制备工艺可行。

2.5 BBR-BSP-Ms 体外释放实验

由图9 可见，在pH 值为7.4 的磷酸缓冲液条件下，BBR 原料药0.5h 内释药达45.76%，存在明显突释行为，4h 累积释放的药物达93.37%，后释放曲线趋于平缓；对比组BBR-Cs 水凝胶有一定缓释作用，12h 内累计释药量近90%；BBR 从BSP-Ms 中随时间缓慢释放，12h 时，BBR 在pH 值为7.4 的磷酸缓冲液中的累积释药量为12.30%，48h 内的累积释放率达82.12%，实验数据表明，药物包载于BSP-Ms后，具有明显的缓释作用效果，有利于创伤愈合、防止突释、延长病灶部位滞留发挥长效作用。