咖啡酸苯乙酯对大鼠早期腹主动脉瘤形成的抑制作用*

占 钻,刘 勇,刘 坚,黄 亮,曹春水

(南昌大学第一附属医院急诊科,南昌 330006)

腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是一种常见的动脉退行性疾病,破裂后死亡率较高,破裂风险与瘤体直径呈正比,对于大AAA(直径>5.5 cm)的主要治疗方法包括开放手术和介入腔内覆膜支架植入术;而对于小AAA(直径<5.5 cm)手术并不能带来获益[1],治疗目标是避免其不断进展甚至破裂,临床上仍没有合适的治疗策略[2],多以观察随访为主。因此,寻找控制和延缓小AAA不断增大的治疗策略对于降低AAA的破裂发生率和死亡率具有重要意义。课题组既往研究发现,咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)对小AAA可能具有保护作用[3],但具体机制有待深入研究。本研究拟通过建立大鼠AAA模型,进一步观察CAPE的干预作用,并从炎性反应角度探讨可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级雄性SD大鼠18只,8周龄,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,适应性喂养1周后随机分为假手术组、模型组及CAPE干预组,每组6只。

1.2 主要试剂

兔基质金属蛋白酶(MMP)-2多克隆抗体、兔MMP-9多克隆抗体、小鼠环氧合酶-2(COX-2)多克隆抗体购自美国Affinity公司,兔前列腺素E2(PGE2)多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司,辣根酶标记山羊抗兔IgG、辣根酶标记山羊抗鼠IgG购自中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1模型制作及干预

大鼠AAA模型制作参考文献[4]。术前大鼠禁食12 h,腹腔注射10%水合氯醛麻醉,充分暴露腹主动脉向上、向下分别达左肾静脉和左侧髂总动脉水平,于左肾动脉开口下方安放无损伤微动脉夹阻断腹主动脉,左侧髂总动脉前壁穿刺置管,结扎左侧髂总动脉远端及右侧髂总动脉。留置管内缓慢推入肝素生理盐水验证腹主动脉是否完全封闭。模型组及CAPE干预组大鼠腹主动脉腔内注入(猪胰)弹性蛋白酶(250 U/mL),加压灌注60 min,松开远端阻断的动脉夹,检查有无回血漏血。确定主动脉无出血后逐层缝合。术后大鼠单笼饲养,CAPE干预组腹腔注射CAPE 10 μmol·kg-1·d-1,每日1次,持续14 d,模型组和假手术组在相同时间内注射等剂量生理盐水。所有大鼠在弹性蛋白酶灌注前、灌注后即刻及灌注后14 d使用游标卡尺测量腹主动脉和AAA直径。使用游标卡尺测量扩张段最大直径超过正常腹主动脉直径的一半作为AAA造模成功的标准。

1.3.2病理学研究

处死大鼠后,取腹主动脉及AAA组织置于10%中性甲醛溶液中固定,脱水、透明、包埋、石蜡切片,行苏木素-伊红染色法(HE)染色、Van Gieson(VG)染色,观察病理学改变情况。免疫组织化学检测血管壁组织COX-2、PGE2、MMP-2及MMP-9水平。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 CAPE对大鼠AAA直径的影响

所有大鼠均存活,造模成功。3组大鼠灌注前腹主动脉直径无明显差异(P>0.05)。模型组及CAPE干预组大鼠灌注后即刻AAA直径比较无差异[(2.38±0.18)mmvs.(2.49±0.05)mm,P>0.05],但均较假手术组腹主动脉直径(1.44±0.08)mm明显增大,差异有统计学意义(P<0.05)。灌注后14 d模型组、CAPE干预组大鼠AAA直径较假手术组腹主动脉直径增大[(3.32±1.23)mm、(2.42±0.14) mmvs.(1.47±0.08) mm,P<0.05)],CAPE干预组较模型组减小(P<0.05),见图1。

a:P<0.05,与假手术组比较;b:P<0.05,与模型组比较。图1 大鼠腹主动脉与AAA直径比较

2.2 CAPE对大鼠AAA形成早期血管壁病理结构的影响

HE染色显示,模型组中动脉血管壁发生退行性病变,中膜部分组织结构紊乱,血管壁炎症浸润明显。而在CAPE干预组瘤样扩张不明显,组织结构较模型组趋于完整,有炎症浸润,但较模型组明显减少。VG染色显示,与假手术组比较,模型组血管壁中膜肌纤维明显减少,胶原纤维紊乱不连续,降解明显,外膜增厚;与模型组比较,CAPE干预组血管壁中膜肌纤维增加,胶原纤维断裂及降解情况好转,见图2。

图2 大鼠腹主动脉及AAA血管壁组织HE染色(400×)和VG染色(100×)对比

2.3 CAPE对大鼠AAA形成早期血管壁组织COX-2、PGE2、MMP-2及MMP-9水平的影响

与假手术组腹主动脉血管壁组织比较,模型组及CAPE干预组AAA血管壁组织COX-2、PGE2、MMP-2及MMP-9水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较,CAPE干预组AAA血管壁组织COX-2、PGE2、MMP-2及MMP-9水平明显降低(P<0.05),见图3、表1。

表1 各组大鼠血管壁组织COX-2、PGE2、MMP-2和MMP-9水平比较

图3 免疫组织化学检测各组大鼠血管壁组织COX-2、PGE2、MMP-2及MMP-9水平(400×)

3 讨 论

AAA的主要病理学改变包括炎性反应、血管平滑肌细胞(VSMC)减少及细胞外基质的降解和重塑[5]。其中,炎性反应在AAA发生和发展中的作用尤为重要,贯穿了从形成至破裂的全过程。研究发现,在AAA血管壁存在大量的炎症细胞浸润[6],巨噬细胞是血管瘤炎性反应的主要效应细胞[7],其高表达于动脉内膜和中膜。有研究发现,抑制进入主动脉壁的免疫及炎性反应可能影响AAA的进展[8-9]。

CAPE是蜂胶中提取出的一种生物活性成分,被广泛应用于烧伤、肿瘤、心血管疾病、糖尿病、局部创伤和皮肤等的治疗,已被证明其具有抗炎症、抗氧化应激、免疫调节和抗肿瘤等多重的生物活性且无毒副作用[10-13]。本实验研究发现,CAPE可抑制AAA不断增大,CAPE治疗后AAA血管壁炎症细胞浸润减少,组织破坏减轻,提示CAPE对大鼠早期AAA形成的抑制作用与抑制炎性反应有关。

PGE2是与炎性反应密切相关的一种前列腺素类化合物,具有促炎作用,其生物合成主要受磷脂酶A(phopholipase A,PLA)、COX-2及前列腺素E2合酶(mPGES-1)的调控。AAA作为一种慢性炎症性疾病,PGE2同样在其发病过程中起着重要作用[14]。研究表明,PGE2介导的炎性反应失调可导致AAA,人AAA组织COX-2和PGE2呈高表达,通过服用非甾体类抗炎药物抑制PGE2的合成能明显减慢AAA的增大速度[15]。通过COX-2/PGE2信号通路的抑制或基因敲除干扰PGE2的合成亦可抑制AAA的进展[16]。

MMPs与AAA的形成及破裂密切相关[17],其中MMP-9及MMP-2在AAA组织中表达水平明显升高[18],其活性增强可以加速血管壁弹性蛋白降解,降低主动脉壁稳定性,进而导致动脉壁瘤样扩张[19]。研究显示,PGE2能够刺激巨噬细胞分泌MMP-2和MMP-9,从而增加动脉粥样斑块的不稳定性,而通过降低COX-2、mPGES-1水平减少PGE2的产生,则能增加其稳定性[20]。PGE2在AAA中调控MMPs的具体机制仍不明确,MAMUN等[21]研究发现通过抑制PGE2的受体EP4通路可降低MMP-2及MMP-9水平,从而抑制动脉瘤进展。

本研究免疫组织化学检测显示,CAPE干预后可有效抑制大鼠AAA血管壁组织COX-2、PGE2、MMP-9及MMP-2水平的升高,提示CAPE对早期AAA的保护作用机制可能与抑制上述指标相关,但具体机制仍需进一步通过基因干扰等体内外研究验证。