基于NF-κB p65通路研究自拟五倍子汤对大鼠肛瘘术后镇痛及炎症抑制的作用机制*

袁泉良,张庆东,郭跃,赵文博

1.南阳市中心医院,河南 南阳 473009; 2.河南省省立医院,河南 郑州 450000

肛瘘(anal fistula,AF)是一种临床常见消化系统疾病,指肛管或直肠与肛门周围皮肤之间形成异常肉芽脓性管道,出现脓肿、溃烂等现象,主要与肛腺感染相关[1]。近年来,AF发病率急剧攀升,且复发率高,严重影响患者生活质量[2-3]。AF难以自愈,临床中常采用手术方式治疗,但由于手术部位的特殊性一般不予缝合,创面大、愈合缓慢和病程长使术后常出现流脓、水肿、瘙痒、出血和疼痛现象等并发症,还会出现身形消瘦和体温升高等症状[4-6]。因此,亟须寻找安全有效的治疗药物解决术后疼痛和炎症问题,对提高患者生活质量有着重大意义。传统中医学治疗AF具有丰富的临床经验,将AF称为“肛漏”,根据中医药理论,借鉴古代及现代中医药临床使用经验,选取具有治疗痔疮脱肛作用的五倍子汤来治疗AF[7-8]。本研究通过建立AF大鼠模型,探讨自拟五倍子汤对AF大鼠术后镇痛、炎症反应的抑制作用及其可能作用机制,旨在为AF临床治疗提供新的治疗思路。

1 材料

1.1 实验动物40只SD大鼠,体质量(220±20)g,动物来源:北京维通利华实验动物技术有限公司,生产许可证号:SCXK(京)2019-0009。实验前所有大鼠在相同饲养环境下适应性饲养7 d,饲养环境设置为:温度20～24 ℃,湿度(50±10)%,12 h明暗交替。适应性饲养期间大鼠可自由进食和饮水。本实验符合南阳市中心医院动物实验伦理批准,批准号:NYZX-KY-2021123。

1.2 药品与试剂自拟五倍子汤(由五倍子20 g,芒硝30 g,桑寄生30 g,荆芥30 g,莲房30 g,大黄 20 g,明矾20 g,赤芍20 g,冰片10 g,枳壳20 g等中药组成,采用高压煎制而成,真空包装,每包150 mL,由河南中医药大学第一附属医院制剂室提供);高锰酸钾(正大丰海药业有限公司,批号:JS030516);肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6 ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所,货号:H052-1、H628、H037);兔抗β-actin多克隆抗体、兔抗大鼠核转录因子-κB p65(nuclear transcription factor-κB p65,NF-κB p65)多克隆抗体、兔抗大鼠环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)多克隆抗体及山羊抗兔二抗IgG(美国CST公司,货号:4970、8242、13314、4413)。

1.3 仪器CFX Connect型荧光定量PCR(美国Bio-Rad公司);Hema9500型基因扩增仪(广东黑马医学仪器有限公司);LEICARM2245型石蜡切片机(德国徕卡公司)。

2 方法

2.1 AF大鼠模型的建立40只SD大鼠适应性饲养7 d后,随机选取10只作为对照组,其余大鼠参考文献方法建立AF大鼠模型[9],具体如下:将大鼠注射戊巴比妥钠麻醉后,观察大鼠肛门状态,待肛门完全放松,以肛缘为界,手术刀切开表面皮肤组织直至直肠黏膜。将创面修剪为三角形缺损,深度达肛门括约肌,于伤口处引入纱布条,注入粪水2 mL,形成“开放、渗血、急性”的状态。反复使用棉签蘸取碘酒溶液擦拭创面,造成局部渗血模拟临床换药刺激,每日1次。造模48 h后观察创面状态,如果有脓性分泌物,则表示伤口感染,模型建立成功。将造模成功大鼠随机分为模型组、自拟五倍子汤组和阳性对照组,每组10只。自拟五倍子汤组大鼠使用自拟五倍子汤煎剂100 mL擦洗创面15 min,擦洗后给予常规包扎[10-11];阳性对照组大鼠使用高锰酸钾稀释液(1：5 000稀释)100 mL擦洗创面15 min,擦洗后给予常规包扎;对照组及模型组给予等量生理盐水擦洗创面,擦洗后给予常规包扎,每天1次,连续干预14 d。

2.2 疼痛行为学检测实验期间正常饮食饮水,给药第1、7、14天干预后,比较各组大鼠的疼痛行为,记录各组大鼠给予刺激后5 min内扭体反应的次数,包括大鼠腹部收紧、身体扭曲、后肢伸展和蠕动等行为;观察并记录大鼠首次舔舐肛周的潜伏时间和5 min内舔舐肛周总时长。

2.3 炎症因子水平检测各组大鼠末次给药后,禁食12 h,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉取血,静置4 h,3 000 r·min-1离心15 min,分离血清,-20 ℃ 保存。实验时提前30 min取出血清样品和ELISA试剂盒,按照TNF-α、IL-1β和 IL-6 ELISA试剂盒说明书要求操作。设置标准管、空白管和样品管,分别于各管加入梯度浓度标准品、蒸馏水和样品50 μL,充分混匀37 ℃水浴30 min,弃液拍干,各孔内加入抗体工作液100 μL,37 ℃孵育 30 min,洗板拍干,加入显色剂避光反应20 min,终止反应。酶标仪蒸馏水调零,测定吸光值,绘制标准曲线,计算待测样品浓度。

2.4 HE染色观察采血完毕后,颈椎脱臼处死大鼠,迅速分离大鼠肛门创面组织,生理盐水冲洗,切取一部分创面组织于4%多聚甲醛溶液中固定24 h备用。将固定好的创面组织使用梯度浓度乙醇溶液脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。采用组织切片机将蜡块切成5 μm的薄片,切片热水中烫平,盖上载玻片,烤箱烘干。苏木精染色液浸染5 min,流水冲洗,盐酸酒精分化10 s,流水冲洗,伊红染液浸染 2 min,流水冲洗,再次脱水透明,中性树脂封片,光学显微镜下观察大鼠创面组织病理学变化。

2.5 RT-PCR检测NF-κBp65mRNA、COX-2mRNA表达水平取部分创面组织,按照RNA提取试剂盒说明书操作,提取总RNA,将RNA逆转录为cDNA后保存备用,cDNA样品稀释10倍为模板,配制反应混合液20 μL,其中TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL、Anchored Oligo(dT)18(0.5 g·L-1) 1 μL、2×TS Reaction Mix 10 μL、总RNA 1 μg、ddH2O 7 μL。反应程序如下:95 ℃预变性10 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火30 s,共进行35个循环。剔除误差较大数据,分析溶解曲线及扩增曲线,根据检测结果以2-△△CT相对定量计算公式计算各样品目的基因相对定量结果并进行分析,所有实验重复3次取平均值。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.6 Western Blot检测相关蛋白表达水平称取适量各组大鼠创面组织,在冰上剪碎并匀浆裂解,加入蛋白酶抑制剂和细胞裂解液,匀浆至充分裂解。低温离心,吸取上清液,BCA法测定蛋白浓度。取20 μg蛋白,12% SDS-PAGE凝胶电泳分离后转至PVDF膜,5%脱脂奶粉摇床封闭2 h,分别加入以 1：2 000 比例稀释的兔抗大鼠一抗NF-κB p65、COX-2和 β-actin抗体,4 ℃孵育过夜,TBST洗膜3次,加入以1：4 000比例稀释的二抗,室温下孵育2 h,TBST洗膜3次,滴加适量ECL发光试剂工作液,静置1 min。凝胶分析系统采集图像并分析,Image J软件分析各蛋白条带灰度值。

3 结果

3.1 各组大鼠5 min内扭体反应情况比较给药第1、7、14天后,与模型组比较,自拟五倍子汤组、阳性对照组大鼠5 min内扭体反应次数显著减少(P<0.05)。与自拟五倍子汤组比较,阳性对照组大鼠 5 min 内扭体反应次数差异无统计学意义(P>0.05)。与给药第1天后比较,给药后第7、14天后自拟五倍子汤组、阳性对照组大鼠5 min内扭体反应次数显著减少(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠5 min内扭体反应情况比较 次)

3.2 各组大鼠首次舔舐肛周潜伏时间比较给药第1、7、14天,与模型组比较,自拟五倍子汤组、阳性对照组大鼠首次舔舐肛周潜伏时间显著增加(P<0.05)。与自拟五倍子汤组比较,阳性对照组大鼠首次舔舐肛周潜伏时间差异无统计学意义(P>0.05)。与给药第1天后比较,给药第7、14天后自拟五倍子汤组、阳性对照组大鼠首次舔舐肛周潜伏时间显著增加(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠首次舔舐肛周潜伏时间比较

3.3 各自大鼠5 min内舔舐肛周总时长比较给药第1、7、14天后,与模型组比较,自拟五倍子汤组、阳性对照组大鼠5 min内舔舐肛周总时长显著减少(P<0.05)。与自拟五倍子汤组比较,阳性对照组大鼠5 min内舔舐肛周总时长差异无统计学意义(P>0.05)。与给药第1天后比较,给药第7、14天后自拟五倍子汤组、阳性对照组大鼠5 min内舔舐肛周总时长显著减少(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠5 min内舔舐肛周总时长比较

3.4 各组大鼠血清炎症因子水平比较与对照组比较,模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,自拟五倍子汤组、阳性对照组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著降低(P<0.05)。与自拟五倍子汤组比较,阳性对照组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 各组大鼠血清炎症因子水平比较

3.5 各组大鼠创面组织病理变化比较结果显示,对照组大鼠创面组织结构完整,未见细胞肿胀、炎性细胞浸润等现象。模型组大鼠创面组织结构破坏严重,细胞间存在大量渗出液,炎性细胞浸润现象较严重。自拟五倍子汤组、阳性对照组大鼠创面组织结构受损现象均得到改善,胞间渗出液减少,炎性细胞浸润现象明显减少。见图1。

注:A:对照组;B:模型组;C:自拟五倍子汤组;D:阳性对照组。图1 各组大鼠创面组织HE染色结果(×200,标尺=50 μm)

3.6 各组大鼠创面组织NF-κBp65mRNA和COX-2mRNA水平比较与对照组比较,模型组大鼠创面组织NF-κBp65mRNA和COX-2mRNA 表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,自拟五倍子汤组、阳性对照组大鼠创面组织NF-κBp65mRNA和COX-2mRNA表达水平均显著降低(P<0.05)。与五倍子汤组比较,阳性对照组大鼠创面组织NF-κBp65mRNA和COX-2mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

表6 各组大鼠NF-κB p65 mRNA和COX-2 mRNA水平比较

3.7 各组大鼠创面组织NF-κB p65和COX-2蛋白表达水平比较与对照组比较,模型组大鼠创面组织NF-κB p65和COX-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,五倍子汤组、阳性对照组大鼠创面组织NF-κB p65和COX-2蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。与五倍子汤组比较,阳性对照组大鼠创面组织NF-κB p65和 COX-2 蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表7、图2。

注:A:对照组;B:模型组;C:自拟五倍子汤组;D:阳性对照组。图2 各组大鼠创面组织NF-κB p65和COX-2蛋白条带图

表7 各组大鼠NF-κB p65和COX-2蛋白表达水平比较

4 讨论

中医理论认为,AF患者多存在湿热现象,湿热下注于肛肠可导致周边经脉瘀滞,邪毒内生,进而引起病理变化,产生溃烂[12-14]。临床中采用的肛痿切除术、挂线术等方式,虽能将溃烂的组织切除,但无法治疗内里,清散体内余毒。手术方式亦会使患者气血受损、经络不通,使得湿热瘀血难以随经络行散而积蕴于肌肤,导致创面难以愈合,患者术后疼痛不已[15-17]。故需及时清热解毒、散瘀化浊以抑制炎症反应,促进创面愈合。因此,针对AF发病机制进行研究,开发新型治疗方式,对提高AF患者生活质量有着重大意义。

近年来,随着对AF研究的深入,一些传统中医药方在临床治疗AF中取得良好效用[18-20]。中医药指出,AF患者接受手术之后,受经脉、肌肉断裂影响,局部湿热和血瘀现象较重,虽使用清热祛瘀的药方口服治疗亦可达到治疗效果,但起效较晚,难以消除患者早期疼痛之苦,故选用汤方直接作用于患处,疗效更佳[21]。五倍子汤来源于《疡科选粹》,在前人的基础上,自拟五倍子汤方可有效清热解毒,收敛效果较佳。故本研究建立AF大鼠模型,探讨五倍子汤对AF大鼠术后镇痛及炎症反应的影响,探究其可能作用机制。在本次研究中,自拟的五倍子汤中五倍子酸涩收敛,可止血、消肿止痛;芒硝有清热、消肿止痛之用;大黄苦寒凉,可清热止血、活血祛痕、泻火解毒,外用能消肿、利湿止痛,三味药共为君药。方中明矾具有敛疮消肿的作用,桑寄生可清热除湿,荆芥可散风热、消疮肿,莲房可化癖止血,赤芍有凉血、散癖止痛的作用,冰片微寒,可消肿止痛。以上诸药共为臣药以奏清热消肿活血止痛的功效。枳壳行气消肿止痛,气行则血行,为佐药。全方偏苦咸寒,起到清热解毒、行气通络、活血散癖、消肿止痛之功。结果显示,模型组大鼠精神萎靡,进食量、饮水量明显减少,创面渗液较多,创口愈合极为缓慢,提示模型组大鼠肛肠组织受到损伤,创面感染且伴有严重的炎症反应。在观察各组大鼠疼痛行为学中发现,在给予自拟五倍子汤和阳性药物干预后,自拟五倍子汤组和阳性对照组大鼠5 min内扭体反应次数、5 min内舔舐肛周总时长显著减少,首次舔舐肛周潜伏时间则显著增加。动物行为是直接反应实验对象当下状态的客观指标,提示各实验组大鼠术后疼痛现象明显改善,自拟五倍子汤和阳性药物可以有效促进大鼠术后创面的恢复。术后疼痛的病理学基础是由炎症因子持续刺激产生,在本研究中发现,自拟五倍子汤组和阳性对照组大鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平均呈降低趋势,表明各组大鼠体内的炎症反应得到抑制,疼痛现象也随之减少。此外,在观察创面组织切片时发现,与模型组比较,各组大鼠创面组织结构受损现象均得到改善,胞间渗出液减少,炎性细胞浸润现象明显减少。进一步证实自拟五倍子汤可以减轻大鼠体内的炎性反应,改善大鼠术后疼痛现象。为验证五倍子汤对AF大鼠的作用机制,将通过NF-κB p65信号通路探讨其对术后疼痛和炎症的作用机制。

NF-κB信号通路是典型的炎症调控信号通路,组织在持续性的炎症微环境暴露下,激活促炎细胞释放大量炎症因子,引发炎症的联级反应[22-24]。在本研究中,模型组大鼠创面组织中NF-κB p65、COX-2 基因与蛋白水平均高度表达,结合大鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平异常升高,提示模型组大鼠创面感染后,体内NF-κB信号通路被激活。NF-κB作为启动炎症的关键因子,从与IκBs形成的复合物中解离进入细胞核,同时促进下游因子COX-2高度表达,COX-2是疼痛诱导阶段的关键限速酶,在促炎因子的刺激下可以迅速表达于局部组织中,直接参与疼痛超敏反应的生理过程[25-26]。在给予大鼠自拟五倍子汤和阳性药物治疗后,检测各组大鼠NF-κB p65信号通路活性时发现,NF-κB p65的蛋白表达活性受到了抑制。p65是NF-κB的一个亚基,是判断炎症反应程度的标志物,NF-κB p65活性受到抑制后,炎症因子水平逐渐下降,相关COX-2基因与蛋白表达水平也逐渐恢复低水平状态,疼痛反应受到抑制[23,27-28]。根据以上研究结果推测,自拟五倍子汤能够抑制AF大鼠纤维化过程和炎症反应,可能是与NF-κB p65/TGF-β1信号通路有关。

综上所述,自拟五倍子汤能够改善AF大鼠血清中炎症因子水平,在一定程度上抑制术后疼痛反应,可能是通过调节NF-κB p65信号通路发挥作用,为临床治疗AF提供实验依据。