根结线虫生防细菌物种多样性及生防潜力研究

刘剑金，莫明和，曹 毅

（1. 云南省烟草公司普洱市公司，云南 思茅 665000；2. 云南大学省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650091；3. 贵州省烟草科学研究院，贵州 贵阳 550081）

植物寄生线虫种类5000 余种，可寄生粮食作物、经济作物、林木及观赏植物等3000 多种植物[1]。全世界每年因植物寄生线虫病害造成的农作物经济损失达到1570 亿美元。其中，以根结线虫属（Meloidogyne spp.）对农业生产危害最为严重[2]。应用化学杀线虫剂是控制农作物根结线虫病害的主要手段，但多数化学杀线虫剂毒性大、污染环境，应用受到限制[3]。利用线虫生防微生物研发生物菌剂并应用于线虫防控是安全、环保的有效措施[7-9]。近年来，利用生防细菌开发的杀线剂已在不同国家登记和应用[4]，但生防菌剂相对较低和不稳定的防效阻碍了其产业化应用。趋化性在线虫中广泛存在，其参与线虫寻找寄主植物和选择适宜的栖息环境[5]。在土壤中，病原线虫二龄幼虫（J2）通过复杂的化感神经元识别来自寄主植物的信号，趋近和侵染根系并建立永久性取食位点[6]。根系生长过程中所营造的低pH 环境及产生的CO2对根结线虫J2 都具有趋化诱吸作用[7]。根系分泌物的特定组分（丹宁酸、黄酮类、糖苷类、脂肪酸、月桂酸等）可通过调节J2 的趋化性来吸引或趋离线虫[8]。同样，线虫生防菌也可释放化学信号吸引线虫自动靠近生防菌。例如杀线虫芽孢杆菌产生二庚酮等信号分子吸引线虫靠近生防菌，进而分泌丝氨酸蛋白酶等毒力因子致死线虫，展现了生防菌诱杀线虫的精细机制[9]。郝玉娥等系统报道了通过产生挥发性物质吸引线虫的细菌种类[10]，但目前为止，利用吸引线虫的生防菌及其趋化底物防控根结线虫病的研究少有报道。文章首先筛选吸引根结线虫J2 的生防菌，测定其趋化性，通过盆栽试验测定吸引线虫的趋化性细菌在与其趋化底物配合施用时的防效，为这类生防菌的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 生防细菌筛选

从云南大学“西南野生生物种质资源库微生物库”获得分离自各种基质的细菌共1471 株，菌株用LB 培养基活化并用LB 液体培养基在37 ℃下培养48 h。取2 mL 培养液于直径3.5 cm 的塑料皿中，加入南方根结线虫J2 悬液（含J2 约200 条）10 μL，以LB 液体培养基替代菌液为对照，每处理3 个重复，室内放置24 h 时镜检，计算杀线率，公式如下：

杀线率（%）=（处理J2 死亡数-对照J2 死亡数）/线虫总数×100。

1.2 生防细菌诱吸活性分析

制备趋化平板：取琼脂糖15 g 溶解于1 L 无菌水中，灭菌后待冷却至40 ℃时依次加入5 mL 磷酸盐缓冲液（K2HPO421.5 g，KH2PO4119 g，定容至1 L，0.22 μm 滤膜过滤除菌）、1M MgSO4溶液1 mL 、1M CaCl2溶液1 mL ，混匀后倒平板。在平板背面用记号笔划线分割区域，沿着直径划线，并在直线两边距离边缘2.0 cm 处分别标记“+”和“-”；以直径中心为起点，左右各0.5 cm 处作标记点，过这2 个标记点作垂直于直径到平板边缘的直线，将整个平板分为A、B、C 3 个区域（图1）。取J2 悬液10 μL（约200 条）点接于平板的中心点（C 区），在A 区上点接生防细菌的LB 新鲜培养液10 μL，在B 区点接液体培养基10 μL 作为对照，每处理3 个重复；用封口膜将平板密封于28 ℃下避光放置2 h，然后统计各区域的J2 数量。A 区、B 区和C 区的J2 数量分别用A、B、C 表示。生防细菌吸引J2 的能力用趋化指数值（Chemotaxis index，CI）表示：CI=（A-B）/（A+B+C），CI 值越高，表示对线虫的吸引能力越强；CI＞0 视为吸引；CI≤0视为无吸引活性[11]。

图1 细菌吸引J2 的平板筛选示意图

1.3 生防细菌系统发育分析

用细菌DNA 提取试剂盒（Cat#DP2001，BioTeke）按说明书提取细菌基因组DNA。以基因组DNA 为模板，采用通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’） 和 492R （5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）扩增16S rRNA 基因。获得PCR 产物由北京华大基因生物有限责任公司用ABI PRISM 3730 DNA 自动测序仪测定基因序列。将16S rRNA 基因序列分别在EzBioCloud 数据库中进行相似性比较，确定菌株的分类地位。

1.4 2 个菌株对尼古丁的趋化测定

尼古丁是烟草根系分泌物的主要成分之一[12]，趋化尼古丁的生防细菌在根际定殖和防效方面具有优势。P.corrugate YMF3.02205 和P.rhodesiae YMF3.02254对J2 的杀线活性和吸引活性最高；为此，参照文献描述的滴定试验法和软琼脂平板群集法[12]测定2 个菌株对尼古丁是否具有趋化性，并以不具有趋化性的Alcaligenes faecalis subsp. faecalis YMF3.02203 菌株为对照。试验平板中所用的尼古丁终浓度为0.2 mM。

1.5 2 个菌株GFP 标记

按文献描述的方法制备感受态细胞[13]。向感受态细胞中加入pDSK-GFPuv 质粒0.5 μL，混匀后置于冰上，将待转化的混合液加入提前置于冰上预冷的1 mm 电转杯中，选择适宜的电转模式后进行电击，电击后迅速向电转杯中加入LB 液体培养基1 mL ，37 ℃，180 rpm 振荡复苏3～5 h，取均匀细胞悬液100 μL 涂布于含40 μg·mL-1卡那霉素的LB 平板上，37 ℃倒置过夜培养，挑取阳性转化子单菌落转接在LB 液体培养基中，37 ℃、180 rpm 过夜培养，最后取菌液10 μL在荧光显微镜40 倍物镜下观察是否有荧光并拍照，获得的阳性转化子编号分别为P.corrugate YMF 3.02205-gfp 和P.rhodesiae YMF3.02254-gfp。

1.6 趋化性生防细菌防治烟草根结线虫的盆栽试验

供试烟草品种为云烟87，3～5 片叶的烟苗从云南省烟草农业科学研究院获得。盆栽土壤取自云南省峨山县烟田，土壤在121 ℃下灭菌1 h 后分装于花盆中（2 kg·盆-1），移栽烟苗，每盆1 株，移栽3 d 时灌根各处理药剂100 mL·株-1，灌药2 d 时接种南方根结线虫J2，1000 条·株-1。处理1：5 亿CFU·mL-1P.corrugate YMF3.02205-gfp 菌悬液；处理2：5 亿CFU·mL-1P.rhodesiae YMF3.02254-gfp 菌悬液；处理3：5 亿CFU·mL-1P.corrugate YMF3.02205-gfp 菌悬液+尼古丁40 μmol·L-1；处理4：5 亿CFU·mL-1P.rhodesiae YMF3.02254-gfp+尼古丁40 μmol·L-1；处理5：10%噻唑膦颗粒剂（山东省联合农药工业有限公司生产），0.5 g·株-1、混土；处理6（CK）：以等量的LB 液体培养基替代菌液作为空白对照。每处理10 盆，在温室里随机排列。移栽60 d 时拔出植株，收集根际土用于测定生防菌生物量，按以下分级标准进行根瘤分级并按公式计算病情指数和防效：2 级：21%～40%的根系有根瘤；3 级：41%～60%的根系有根瘤；4 级：61%～80%的根系有根瘤；5级：81%～100%的根系有根瘤。并按以下公式计算病情指数和防效：病情指数=（n1×1+ n2×2+ n3×3+ n4×4+n5×5）/（S×5）×100，n1-n5分别代表根瘤病级指数；防效（%）=100（1-x/y），x、y 分别代表处理和空白对照的病情指数。

生防菌根际生物量测定：每烟株取根际土1 g 用无菌水梯度稀释后涂布于含40 μg·mL-1卡那霉素的LB 抗性平板上，3 个重复，37 ℃培养48 h，计数平板上的CFU，以平均每克根际土的菌落数表示生物量。

2 结果与分析

2.1 根结线虫生防细菌筛选

由图2 可知，以南方根结线虫J2 为靶标，测定了1471 株细菌发酵液对J2 杀线活性，结果显示99 株细菌对J2 的杀线率≥30%。其中，杀线率在30.00%～39.99%的有46 株，40.00%～49.99%的有27 株，50.00%～59.99%的有10 株，60.00%～69.99%的有12 株，70.00%以上的有4 株。

图2 在不同杀线率区间南方根结线虫J2 的菌株数

2.2 根结线虫生防细菌诱吸活性及种群组成分析

由图3 可知，在上一实验中获得的99 株根结线虫生防细菌中，58 株对J2 显示出不同程度的诱吸活性（CI＞0），占58.58%。其中，11 株的CI＞0.2，显示出较强的活性，占根结线虫生防细菌总数的18.97%；20 株显示出中等诱吸活性（0.1＜CI≤0.2），占34.48%；27 株显示出弱诱吸活性（0＜CI≤0.1），占46.55%；41 株无诱吸活性（CI≤0），占41.41%。

图3 生防细菌对南方根结线虫J2 诱吸活性评估（A）及种群组成分析（B）

基于16S rRNA 序列分析，这58 株具有诱吸活性的生防细菌归属于放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）4 个大类。其中，厚壁菌门种类最多，共30 株，占具有吸引根结线虫活性菌株总数的51.72%。在厚壁菌门中，芽孢杆菌属（Bacillus）为优势属，共6种16 株菌。变形菌门（Proteobacteria）共有21 株，占总数的36.21%，假单胞菌属（Pseudomonas）为优势属，共4 种10 株菌。放线菌门有4 个属6 株。在所有菌株中，P.corrugate YMF3.02205 和P.rhodesiae YMF3.02254 对J2 的活性最高（死亡率分别为71.25%和74.63%）、吸引活性也最高（CI 值分别为2.17 和2.46），被选择用于后续的GFP 标记和盆栽试验。

2.3 2 个菌株的尼古丁趋化性测定及GPF 标记

如图4 所示，在滴定测定法中，P.corrugate YMF3.02205（图4-A2）、P.rhodesiae YMF3.02254（图4-A3）向平板中央的化合物趋向性运动，在添加的尼古丁附近形成明显的趋化圈；而对照菌株A.faecalis subsp. faecalis YMF3.02203 并未形成趋化圈（图4-A1）。在软琼脂法平板法中，P.corrugate YMF3.02205（图4-B2）、P.rhodesiae YMF3.02254（图4-B3）从平板中央的接种点向外趋向性运动而形成明显的趋化圈；而对照菌株A.faecalis subsp. faecalis YMF3.02203 并未形成趋化圈（图4-B1）。2 种方法的测定结果表明P.corrugate YMF3.02205（图4-A2）、P.rhodesiae YMF 3.02254 对尼古丁具有趋化性。

图4 尼古丁趋化性测定

预实验中P.corrugate YMF3.02205、P.rhodesiae YMF3.02254 在含40 μg·mL-1卡那霉素的抗性平板上不能生长。通过电转化法将携带绿色荧光蛋白基因的重组载体pDSK-GFPuv 导入生防菌株中，通过40 μg·mL-1卡那霉素的单抗平板以及荧光显微镜下观察荧光的双重验证（图5），成功获得GFP 基因标记的2 株生防菌：P.corrugate YMF3.02205-gpf、P.rhodesiae YMF3.02254-gfp。

图5 2 个菌株的显微形态

2.4 2 个菌株对烟草根结线虫病的防效

表1 显示了2 株趋化性生防菌对烟草根结线虫病的防效及其根际定殖能力。从防效上看，P.corrugate YMF3.02205-gpf、P.rhodesiae YMF3.02254-gfp 对根结线虫病的防效分别为65.5%和67.3%；添加尼古丁40 μmol·L-1时，2 株生防菌的防效显著提高，分别为75%和76.9%，但低于化学药剂噻唑膦的防效85.1% 。 从根际定殖量上看，P.corrugate YMF 3.02205-gpf、P.rhodesiae YMF3.02254-gfp 在每克根际土中的生物量分别为0.47×103CFU 和0.54×103CFU；添加尼古丁40 μmol·L-1时，2 株生防菌的根际定殖量显著提高，分别为12.17×103CFU 和10.62×103CFU。

表1 2 个菌株对烟草根结线虫病的防效及其根际生物量

3 讨论

生防菌控制病原线虫的机制主要包括寄生、捕食、毒杀、拮抗、诱导植物抗性。相对于线虫在土壤中的快速和远距离移动，细菌的移动非常缓慢、距离有限。在长期进化中一些土壤细菌会通过产生挥发性有机物吸引线虫靠近菌体，进而毒杀线虫而获得营养[9，14]；因此能吸引线虫的生防细菌作为生防资源更具有开发和应用价值。然而目前对线虫具诱吸活性的生防菌资源发掘有限。文章报道了58 株能吸引线虫的生防细菌，其分类地位分属多种分类单元，充分体现了这类资源的物种多样性。生防菌在根际有效定殖并建立相应种群是发挥其生防功能的先决条件。生防菌在土壤中的萌发、生长和定殖严重受到“土壤抑生作用（Soil biostasis）”的影响，进而负面影响其防效和稳定性[15]。根结线虫病为土传病害，“生防菌-植物根系-靶标线虫”的互作关系直接影响生物杀线剂的防效；在这三角互作关系中，生物趋化性介导的互作不可或缺。趋化性（chemotaxis）泛指生物（如生防细菌、根结线虫J2）感受化学效应子信号（如诱吸物、趋避物），调控其运动行为，进而趋近有利环境或趋离不利环境的过程[16]。趋化性生防菌对根系分泌物的趋化对其根际定殖和发挥防效至关重要。植物促生菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在根际定殖时，首先通过趋化系统感受拟南芥根系分泌物而趋近根系，在接触根系几小时后才产生生物膜分泌细胞并开始定殖过程[17]。目前，有关趋化性生防菌趋化根系分泌物的机制及对生防菌根际定殖能力和防效的影响认识不足；具有吸引线虫并趋化根系分泌物的生防菌的生防潜力未见报道。本研究结果表明，既能吸引根结线虫又能趋化烟草根系分泌物的生防菌Pseudomonas corrugate YMF3.02205 和 P.rhodesiae YMF3.02254 对烟草根结线虫有良好防效（65.5%和67.3%），特别是生防菌与根系分泌物尼古丁配合使用时能显著提高其防效和根际定殖力。Ma 等[18]报道了类似的研究结果，发现烟草根系分泌物尼古丁作为趋化底物能提高生防菌Pseudomonas aeruginosa NXHG29 的趋化性、根际定殖力和对烟草黑胫病的防效。韦玉倩等[12]发现，当在菌液中添加40 μmol·L-1尼古丁时，生防菌Brevibacillus brevis Hs8-19，Br.brevis Hs8-13 和P.tremae Ht3-25 对烟草黑胫病的防效分别增加了6.11%、4.79%和4.72%。以上研究充分表明，趋化性生防菌是一类重要的生防资源，是研究生防菌与宿主互作的理想材料，也是开发生防菌剂理想资源，值得加大研发力度，充分发挥这类资源在农业上的应用价值。