甲胎蛋白阴性肝癌患者血清外泌体circ RNA100338和CRNDE表达水平及预后预测价值研究

段世举（联勤保障部队第九四二医院检验病理科，银川 750001）

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的肝癌类型，占所有肝癌的75%[1]。甲胎蛋白（α fetoprotein，AFP）是临床常用的HCC筛查和预后评估指标，但仍有30%～40%的HCC患者血清AFP处于正常水平，即AFP阴性的肝细胞癌(AFP-negative hepatocellular carcinoma,AFP-NHCC)[2]。因此，有必要寻找能够评估AFP-NHCC患者临床预后的血清标志物。外泌体是直径在30～150nm的细胞外分泌双层囊泡，能在细胞间传递蛋白质、DNA和RNA分子等，参与炎症、免疫及肿瘤等生理和病理过程[3]。环状核糖核酸（circular RNA，circ RNA）100338是一种非编码RNA，能够激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路，促进胃癌等肿瘤的增殖及转移[4]。ZHOU等[5]对HCC癌组织和癌旁组织中差异性表达的circ RNA进行分析，发现circ RNA 100338表达显著上调，可能是新的HCC肿瘤标志物。长链非编码RNA结直肠肿瘤差别表达 (colorectal neoplasia differentially expressed，CRNDE)基因位于16号染色体，其能够结合miRNA-338-3p，调控肺癌等恶性肿瘤的增殖和侵袭能力[6]。研究表明，在HCC组织和肿瘤细胞中CRNDE表达上调，其通过促进HCC肿瘤细胞的增殖和转移，促进HCC的肿瘤进展[7]。但目前AFPNHCC患者血清外泌体circ RNA 100338，CRNDE的表达及临床预后价值尚不清楚。本研究通过检测AFP-NHCC患者血清外泌体circ RNA100338和CRNDE的表达，探讨两者与临床病理特征的关系及临床预后价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2018年1月～2019年7月期间联勤保障部队第九四二医院接受手术治疗的AFP-NHCC患者98例为AFP-NHCC组。纳入标准：①经过术后病理检查确诊为HCC；②AFP＜20 μg/L；③首次诊治，术前无放化疗、靶向治疗及中药治疗等；④临床和病理随访资料完整。排除标准：①并发其他器官恶性肿瘤；②其他病理类型的肝癌，如胆管细胞癌、混合型肝癌等；③并发急性感染性疾病；④妊娠哺乳期妇女。AFP-NHCC组中，男性66例，女性32例；年龄38～78（62.58±8.81）岁；肿瘤分化程度：高中分化52例，低分化46例；肿瘤直径：≤5cm 57例，＞5 cm 41例；肿瘤结节数目：＜2个76例，≥2个22例；包膜完整59例，不完整39例；BCLC分期：0～A期41例，B～C期57例；伴有肝内淋巴结转移38例。以同期70例健康查体的健康人为对照组，其中男性48例，女性22例；年龄35～79（61.78±9.14）岁。两组在性别、年龄之间比较，差异均无统计学意义（χ2=3.152,t=0.548,均P＞0.05）。本研究经本院伦理委员会审核批准通过。

1.2 仪器与试剂 HiPure Exosome RNA Midi Kit外泌体RNA分离提取试剂盒（美国Invitrogen公司，R4319-02），透射电镜（日本高新技术公司，HT7700），反转录试剂盒（北京索莱宝公司，货号RP1105），引物由深圳华大基因生物公司设计合成，QuantStudio5实时荧光定量PCR仪（美国赛默飞世尔公司）。

1.3 方法

1.3.1 实时荧光定量PCR检测血清外泌体circ RNA100338和CRNDE表达：取各组研究对象清晨空腹静脉血5ml，2 500r/min离心15min，分离血清。按试剂盒说明书分离血清外泌体，电镜下观察外泌体形态，为双圆盘结构的囊泡，大小介于30～200nm，然后提取外泌体总RNA。将总RNA反转录为cDNA后进行实时荧光定量PCR反应。circ RNA 100338正向引物序列：5’-AAAAGCAAGCAGTGC CCATA-3’，反向引物：5’-GCTCGAATCAGGTCC ACCA- 3’；CRNDE引物正向引物序列：5’-CATCCG CTACCTCATCTCGT-3’，反向引物：5’- GTTGCT ACCACCACTCCCATA-3’; GAPDH正向引物：5’-G CACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，反向引物：5’-C CCCTTTTCTGCTAAATGAACTCT-3’。反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，70℃延伸30s，共40个循环。反应体系：SYBR GREEN Premix 10μl，上下游引物各1μl，cDNA 2μl和无RNA酶水 6μl。以GAPDH为内参，血清外泌体circ RNA100338，CRNDE的表达采用2-△△Ct法表示。以circ RNA100338和CRNDE相对表达量的平均值2.78，3.05作为临界值,分为circ RNA 100338高表达组（n=48）和circ RNA100338低表达组（n=50）,CRNDE高表达组（n=47）和CRNDE低表达组（n=51）。

1.3.2 随访：所有患者出院后开始随访，每三月随访一次，随访三年，以电话或门诊复查方式进行，随访内容为患者生存情况、死亡时间等内容。随访截止至2022年8月1日，随访终点为死亡或随访结束。

1.4 统计学分析 应用SPSS 24.0软件进行数据分析。计数资料采用百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。符合正态性分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验。受试者工作特征曲线（receiver operating curve，ROC）分析外泌体circ RNA100338，CRNDE评估BCLC分期B～C期、低分化程度及肝内淋巴结转移的临界值。Kaplan-Meier生存分析（Log-rank检验）分析血清外泌体circ RNA100338，CRNDE对AFPNHCC患者预后的影响。单因素及多因素COX回归分析影响AFP-NHCC患者预后的因素。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清外泌体circ RNA100338和CRNDE水平比较 AFP-NHCC组患者血清外泌体circ RNA 100338和CRNDE的相对表达量分别为2.78±0.67，3.05±0.70，高于对照组（0.92±0.31，1.06±0.29），差异具有统计学意义（t=21.619，22.435，均P=0.000）。

2.2 AFP NHCC组患者血清外泌体circ RNA100338与CRNDE相关性 AFP-NHCC组患者血清外泌体circ RNA100338与CRNDE表达呈显著正相关性（r=0.657，P=0.000）。

2.3 不同临床病理特征AFP-NHCC患者血清外泌体circ RNA100338和CRNDE表达比较 见表1。BCLC分期B～C期、低分化程度及并发肝内淋巴结转移AFP-NHCC患者血清外泌体circ RNA100338，CRNDE表达分别高于BCLC分期0～A期、高中分化程度及无肝内淋巴结转移患者，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 血清外泌体circ RNA100338，CRNDE与AFP-NHCC患者临床病理特征的关系（±s）

类别ncirc RNA100338tPCRNDEtP年龄（岁） <60402.64±0.70 1.7710.080 2.95±0.75 1.1660.246≥60582.88±0.633.12±0.68性别 男662.80±0.65 3.11±0.64 0.4050.686女322.74±0.762.92±0.80肿瘤分化程度 高中分化522.02±0.64 1.97±0.61 11.7070.000低分化463.64±0.734.27±0.74肿瘤直径（cm） ≤5572.69±0.65 2.95±0.66 1.5290.129＞5412.91±0.773.19±0.74肿瘤结节数目（个） ＜2762.75±0.64 3.03±0.65 0.8130.418≥2222.88±0.733.12±0.79包膜完整性 完整592.69±0.61 3.01±0.62 1.6880.095不完整392.92±0.733.11±0.77 BCLC分期 0～A411.87±0.60 2.13±0.61 11.6480.000 B～C573.43±0.693.71±0.75 1.2680.208 16.8570.000 1.6880.095 0.5440.588 0.7090.480 11.1000.000肝内淋巴结转移 有383.96±0.79 4.39±0.76 13.6990.000 15.2110.000无602.03±0.602.20±0.65

2.4 ROC曲线分析外泌体circ RNA100338和CRNDE评估BCLC分期B～C期、低分化程度及肝内淋巴结转移的临界值 见图1。外泌体circ RNA100338评估BCLC分期B～C期、低分化程度及肝内淋巴结转移的临界值分别为3.51，3.69和4.06，外泌体CRNDE评估BCLC分期B～C期、低分化程度及肝内淋巴结转移的临界值分别为3.79，4.31和4.45。

图1 ROC曲线分析外泌体circ RNA100338，CRNDE评估BCLC分期B～C期、低分化程度及肝内淋巴结转移的临界值

2.5 血清外泌体circ RNA100338和CRNDE表达对AFP-NHCC患者预后的影响 见图2。本研究中，随访4～36个月，死亡30例，失访2例。circ RNA100338高表达组和低表达组患者三年总体生存率分别为52.08%（25/48），86.00%（43/50）。Kaplan-Meier生存分析显示，circ RNA100338高表达组患者累积生存率低于低表达组患者，差异有统计学意义(Log-Rankχ2=12.490,P=0.000)。CRNDE高表达组和低表达组患者三年总体生存率分别为51.06%（24/47），86.27%（44/51）。CRNDE高表达组患者累积生存率低于低表达组患者，差异有统计学意义(Log-Rankχ2=15.050，P=0.000)。

图2 血清外泌体circ RNA100338，CRNDE表达对AFP-NHCC患者预后的影响

2.6 单因素及多因素COX回归分析影响AFPNHCC患者预后的因素 见表2，3。以AFPNHCC患者的预后为因变量（1=死亡，0=存活，t=时间），将单因素分析结果差异有统计学意义的因素（P＜0.05）纳入多因素COX分析，结果显示，肿瘤BCLC分期B～C，低分化程度、有肝内淋巴结转移、circ RNA100338高表达及CRNDE高表达是影响AFP-NHCC患者预后的独立危险因素。

表2 单因素COX比例风险回归模型分析

表3 多因素COX比例风险回归模型分析

3 讨论

HCC具有起病隐匿、发病机制复杂及病情进展迅速等特点，严重威胁我国人民健康。AFP是临床上HCC最常用的肿瘤标志物，广泛用于HCC的早期筛查，但临床上仍有部分AFP-NHCC 患者AFP呈低水平。AFP-NHCC疾病具有临床症状隐匿，影像学表现不明确等临床特点，并且其临床预后特点的研究报道较少[8]。因此，需深入研究AFP-NHCC的疾病机制。外泌体又称为细胞外囊泡，是具有双层磷脂结构的微小囊泡，其能够释放到细胞外进入血清、尿液等体液中，并通过直接融合、胞吞及细胞表面蛋白结合，将外泌体中含有蛋白、核酸等物质进行细胞间传递，是理想的肿瘤血清肿瘤标志物[9]。

circ RNA是具有共价闭合环状结构的RNA分子，不易被核酸外切酶降解，具有较高的稳定性。circ RNA100338是一种新的circ RNA分子，其能够诱导血管新生，在心肌缺血再灌注损伤中发挥重要的调控作用[10]。本研究中，AFP-NHCC组患者血清外泌体circ RNA100338明显升高，与既往报道一致[11]。CHENG等[11]报道，circ RNA100338作为内源竞争性RNA，与miR-141-3p的竞争性结合，促进ZEB1的表达，促进HCC肿瘤细胞的恶性增殖。此外，本研究中circ RNA100338表达与不良临床病理特征有关，提示circ RNA100338参与AFP-NHCC的肿瘤恶性进展。HUANG等[12]人报道，在肝癌肿瘤细胞中circ RNA100338能够与miR-141-3p结合，促进下游侵袭和增殖基因的表达，导致肿瘤的侵袭和增殖能力增强。有学者发现，利用哌拉斯汀特异性抑制HCC肿瘤细胞中circ RNA100338的表达，能够显著抑制下游增殖相关基因的表达，抑制体内外HCC肿瘤的增殖及转移[11]。本研究中，血清外泌体circ RNA100338高表达的AFP-NHCC患者生存预后较差。分析其原因，一方面是circ RNA100338能够促进脑Ras同源蛋白的表达，激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路，促进HCC肿瘤细胞的恶性增殖和转移，增加AFP-NHCC患者术后肿瘤复发转移的风险，导致患者的不良生存预后[13]。另一方面是HCC中circ RNA100338的表达上调能够促进ZEB1的表达[11]，而ZEB1能够通过诱导肿瘤细胞上皮间质转化的发生，增强肿瘤细胞对顺铂、多西他赛等化疗药物治疗的抵抗性[14]。

CRNDE是一种多功能LncRNA，最早在结直肠癌中发现，后来在胶质瘤等多种恶性肿瘤中均发现其是一种肿瘤促进因子[15]。本研究中，AFPNHCC患者血清外泌体中CRNDE表达升高，与BCLC分期、分化程度及肝内淋巴结转移有关，这与JI等[7]在肝癌肿瘤组织中研究结果一致。LIU等[16]报道，HCC肿瘤中CRNDE能够增强组蛋白H3K9和H3K27乙酰化，促进p300/YY1复合物结合表皮生长因子受体基因启动子，激活表皮生长因子受体及其介导的下游信号传导，促进HCC肿瘤细胞的增殖。CRNDE还能够作为分子海绵，结合并调控微小RNA的表达，调控下游基因表达，影响肿瘤的恶性生物学行为。LIN等[17]报道，HCC中CRNDE能够作为分子海绵结合miR-33a-5b，促进miR-33a-5b下游靶点细胞周期素依赖激酶6的表达，加速肿瘤细胞由G0期向G1期的转换，促进HCC肿瘤细胞的恶性增殖。此外，CRNDE还能通过抑制线粒体凋亡相关的蛋白质，如天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶3，Bax等的表达，抑制HCC肿瘤细胞凋亡[17]。本研究发现，CRNDE高表达是影响AFP-NHCC患者不良生存预后的独立因素。CHEN等[18]学者报道，CRNDE的表达升高能够通过结合miR-543，增强自噬相关蛋白4同源物B mRNA的稳定性，促进HCC细胞自噬的发生，增强HCC肿瘤细胞对索拉非尼治疗的抵抗性。ZHANG等[19]发现，CRNDE能够与富含丝氨酸-精氨酸剪接因子6结合，促进胃癌肿瘤细胞自噬及对铂类化疗药的耐药性形成。研究发现，CRNDE在表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药的肿瘤细胞中高度表达，CRNDE能够与真核翻译起始因子4A3蛋白结合形成复合体，促进表皮生长因子受体的磷酸化激活，导致耐药肿瘤细胞的过度增殖[20]。因此，CRNDE可能是作为AFP-NHCC中潜在的预后标志物，以CRNDE为靶点的抗化疗耐药治疗可能有助于改善AFP-NHCC患者的临床预后，值得临床深入研究。本研究中，AFP-NHCC患者血清外泌体中circ RNA100338与CRNDE表达呈正相关，提示两者可能存在相互作用。circ RNA100338与CRNDE均是非编码RNA，circ RNA100338能够通过直接或间接作用与CRNDE结合，调控肿瘤细胞内增殖、侵袭、迁移、凋亡和干性维持等多种生物学过程[21]。但AFP-NHCC中两者具有的作用机制有待今后设计基础实验进行深入探索。

本研究初步通过ROC曲线，确定外泌体circ RNA100338，CRNDE对BCLC分期B～C期、低分化程度及肝内淋巴结转移诊断的临界值，有助于辅助临床医生对AFP-NHCC患者疾病严重程度进行评估，指导临床诊治。但本研究由于样本量有限，有待今后设计多中心大样本临床实验，进一步验证外泌体circ RNA100338，CRNDE临界值的临床应用价值。

综上所述，AFP-NHCC患者血清外泌体中circ RNA100338，CRNDE表达升高，两者表达与肿瘤BCLC分期、肿瘤分化程度及肝内淋巴结转移有关。血清外泌体circ RNA100338，CRNDE高表达AFPNHCC患者预后较差，是潜在的AFP-NHCC预后相关肿瘤标志物，有助于临床医生对不同疾病进展风险的AFP-NHCC患者进行个体化治疗。但本研究存在一定不足，本研究未对治疗前后血清外泌体circ RNA100338，CRNDE的动态变化及两者在AFP-NHCC中具体作用机制进行研究，有待今后进行深入的临床及基础研究。