KIF18B通过激活Wnt/β catenin信号通路促进子宫内膜癌细胞增殖和转移的实验研究

陆 瑞，郭红霞，吴苗苗，吴志兵，姜 雪，戈伍琼（南京中医药大学沭阳附属医院妇产科，江苏宿迁 223600）

子宫内膜癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，约占女性癌症的4.8%[1]。晚期子宫内膜癌患者通常具有侵袭转移性和复发率高的特征，对传统治疗策略的反应通常较差[2-3]。因此迫切需要寻找有效的靶向治疗分子靶点，以改善子宫内膜癌患者的治疗效果和预后。驱动蛋白家族成员18B（kinesin family member18b,KIF18B）与有丝分裂中染色体的配对和分离密切相关[4]。研究报道，在前列腺癌、卵巢癌和胃癌等肿瘤中，KIF18B表达增加并发挥促癌作用，可作为抗肿瘤治疗的潜在分子靶标[5-7]。KIF18B在子宫内膜癌中的研究尚未见有报道，而研究显示，在肿瘤进展过程中，Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路的激活起着重要作用[8]，KIF18B可激活Wnt/β-catenin信号通路，促进乳腺癌、宫颈癌、肝细胞肝癌等恶性肿瘤的进展[9-11]。因此，本研究分析KIF18B在子宫内膜癌组织中的表达及功能，旨在为探索子宫内膜癌新的治疗靶点提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2014年7月～2017年6月南京中医药大学沭阳附属医院留存的50例子宫内膜癌组织和30例正常子宫内膜组织标本，均术中获取，液氮保存。子宫内膜癌患者纳入标准：①经病理切片确诊为子宫内膜癌；②首次确诊，入组前未接受任何治疗；③临床资料齐全。排除标准：①并发其它恶性肿瘤；②并发传染病、血液病等。子宫内膜癌患者年龄43～70岁，中位年龄53岁；正常子宫内膜组织患者年龄40～65岁，中位年龄50岁。本研究患者及家属均知情同意，获得医院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 甲醛、无水乙醇、石蜡及二甲苯（天津市风船化学试剂科技有限公司）；枸橼酸钠抗原修复液（上海跃腾生物技术有限公司）；聚腺苷二磷酸核糖聚合酶蛋白裂解试剂（北京索莱宝试剂公司）；KIF18B一抗（英国Abcam公司）；免疫组化检测试剂盒（丹麦DAKO公司）；二喹啉甲酸蛋白浓度检测试剂盒和TOP/FOP Flash检测试剂盒（深圳市康之健医疗设备生物科技有限公司）；聚偏氟乙烯膜（美国millipore试剂公司）；电化学发光试剂盒（翌圣生物科技上海有限公司）；胎牛血清，DMEM培养液和青霉素/链霉素双抗（美国Gibco试剂公司）；Lip2000转染试剂盒（美国Invitrogen公司）；KIF18B siRNA（上海吉凯基因有限公司）；噻唑蓝检测试剂盒（上海酶联生物科技公司）；Transwell小室（美国Thermo公司）；结晶紫（美国Sigma公司）；Wnt3a，β-catenin，cMYC，细胞周期蛋白D1（cyclinD1），基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase，MMP-2），MMP7一抗和GAPDH一抗（美国proteintech公司）；子宫内膜癌细胞系Ishikawa（美国ATCC细胞库）。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学染色检测KIF18B的表达：将标本组织脱水，石蜡包埋，制成4 μm切片，在70℃下烘烤1h。切片经脱蜡、水化和抗原修复处理，封闭后与KIF18B一抗4℃孵育过夜，第二天添加二抗，室温下孵育 30 min，加入DAB显色液15 min，苏木素复染、脱水、封片后在显微镜下观察。根据染色强度和阳性细胞比例得到免疫组织化学染色结果，免疫染色强度评分：无色为 0 分，浅黄色为 1 分，棕黄色为 2 分，棕褐色为 3 分；阳性细胞比例评分：≤ 5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，50%～75%为3分，>75%为4分。染色强度评分和阳性细胞比例评分相乘得到免疫组化染色评分，0～4分为阴性（-）；5～8分为阳性（+）；9～12分为强阳性（+++）。

1.3.2 细胞培养：子宫内膜癌细胞系Ishikawa复苏后重悬至DMEM完全培养液中，放置于37℃，含有5%（v/v）CO2的加湿细胞培养箱中培养。倒置显微镜下观察细胞状态，当细胞密度达90%时，采用胰酶消化重悬细胞，按照1∶3进行细胞传代，取生长状态较好的细胞进行实验。

1.3.3 细胞转染及分组：培养的Ishikawa细胞稀释后按1.0×105个/孔的密度接种于6孔板中，采用Lip2000转染试剂盒将NC siRNA，KIF18B siRNA分别转染至Ishikawa细胞，设为si-NC组和si-KIF18B组。更换DMEM完全培养液继续培养48 h，采用蛋白免疫印迹法检测KIF18B siRNA的转染效率。

1.3.4 蛋白免疫印迹法检测蛋白表达：收集si-NC组和si-KIF18B组Ishikawa细胞，加入蛋白裂解液，低温高速离心去除细胞碎片，采用二喹啉甲酸试剂盒测定蛋白质的含量。对蛋白质以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，并转移至聚偏氟乙烯膜上。将膜放置在5g/dl的牛血清清蛋白中常温孵育1h，加入一抗，4℃孵育过夜，与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG（稀释1∶5 000）或山羊抗兔IgG（稀释1∶5 000）室温孵育1h。使用电化学发光试剂盒曝光蛋白条带。

1.3.5 噻唑蓝比色法检测细胞增殖能力：将si-NC组和si-KIF18B组Ishikawa细胞以1.0×103个/孔接种到96孔板中，设置6个重复孔及6天的细胞量，放置在培养箱中培养。细胞贴壁后，每孔加入10 μl的噻唑蓝试剂，继续置于培养箱中2h，采用酶标仪测定各孔细胞在490 nm的吸光度值。

1.3.6 Transwell实验：将si-NC组和si-KIF18B组Ishikawa细胞以浓度1×105/ml重悬于无血清DMEM培养液中，取100μl均匀铺于Transwell小室的上室，下室添加完全培养液。在37℃下孵育24 h后，丢弃上室培养液，用PBS液冲洗2次。用甲醛固定转移的细胞，并用0.5g/dl结晶紫染色。随机选择视野采用显微镜观察并计数。

1.3.7 双荧光素酶报告基因实验：将si-NC组和si-KIF18B组Ishikawa细胞以1.0×103个/孔接种到96孔板中，设置3个重复孔，并设置空白对照组，放置在培养箱中培养。采用Lip2000转染试剂盒将TOP-Flash，FOP-Flash质粒转染到各组细胞中，置于细胞培养箱中48h，添加荧光素酶报告基因检测试剂测定各组细胞的荧光素酶活性。

1.4 统计学分析 采用SPSS21.0软件进行数据分析，计数资料以率（%）表示，行χ2检验；正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，行独立样本t检验。Log-rank法分析患者的生存情况。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 KIF18B在子宫内膜癌组织中的表达 KIF18B在子宫内膜癌组织中的阳性表达率为70.00%（35/50），与正常子宫内膜组织中的43.75%（7/16）比较，差异有统计学意义（χ2=11.667,P=0.001）。

2.2 KIF18B与临床病理特征的关系 见表1。KIF18B阳性表达与年龄、肌层浸润深度和分化程度无关，差异无统计学意义（均P>0.05），与FIGO分期、淋巴结转移有关，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 KIF18B与临床病理特征的关系 [n（%）]

2.3 KIF18B表达对子宫内膜癌患者预后的影响 见图1。以免疫组织化学染色评分均值6.96为界，分为KIF18B低表达组（<6.96分，35）和KIF18B高表达组（>6.96分，15）。Kaplan-Meier绘制生存曲线，结果显示KIF18B高表达组五年总生存率34.29%（12/35）低于KIF18B低表达组的66.67%（10/15），差异有统计学意义（χ2=4.305，P=0.038）。

图1 KIF18B低表达组和KIF18B高表达组子宫内膜癌患者生存曲线

2.4 KIF18B siRNA转染子宫内膜癌细胞的效果KIF18B在si-KIF18B组细胞中的表达为0.15±0.04，在si-NC组细胞中的表达为1.01±0.03，KIF18B siRNA抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa中KIF18B的表达，差异有统计学意义（t=29.790，P<0.001）。

2.5 KIF18B siRNA对子宫内膜癌细胞增殖能力的影响 见表2。第1天si-KIF18B组和si-NC组细胞增殖率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。第2～5天si-KIF18B组细胞增殖率均显著低于si-NC组，差异有统计学意义（均P<0.05）。

表2 不同时间点子宫内膜癌细胞增殖率比较（±s）

时间si-NC组si-KIF18B组t值P值第1天0.21±0.010.22±0.011.2250.275第2天0.39±0.050.28±0.033.2670.033第3天0.64±0.020.36±0.059.006<0.001第4天1.02±0.110.54±0.066.635<0.001第5天1.39±0.080.71±0.0711.080<0.001

2.6 KIF18B siRNA对子宫内膜癌细胞转移能力的影响 si-KIF18B组细胞穿膜数目为39.67±4.52个，si-NC组细胞穿膜数目为74.33±4.51个，干扰KIF18B表达后子宫内膜癌细胞 Ishikawa转移能力降低，差异具有统计学意义(t=9.402，P<0.001)。

2.7 KIF18B对子宫内膜癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路活性的影响 si-KIF18B组细胞中荧光素酶相对活性为0.41±0.04，si-NC组荧光素酶相对活性为1.00±0.03，干扰KIF18B表达后Wnt/β-catenin信号通路活性下降，差异有统计学意义(t=20.438，P<0.001)。

2.8 KIF18B对子宫内膜癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的影响 见表3。si-KIF18B组Wnt3a，β-catenin，cMYC，cyclinD1，MMP2和MMP7蛋白表达低于si-NC组，差异具有统计学意义（均P<0.05）。

表3 KIF18B siRNA对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白及其下游基因表达的影响（±s）

项目si-NC组si-KIF18B组t值P值Wnt3a0.74±0.060.09±0.0217.801<0.001 β-catenin0.55±0.040.13±0.0314.549<0.001 cMYC0.63±0.060.40±0.064.6950.005 cyclinD10.91±0.030.36±0.0516.337<0.001 MMP20.92±0.030.16±0.0236.509<0.001 MMP70.60±0.030.14±0.0125.195<0.001

3 讨论

近年来，由于生活方式的改变，子宫内膜癌的发病率和死亡率一直在增加，严重威胁女性的生命健康[1]。随着医疗科学的发展，虽然治疗手段在不断的进步，但是子宫内膜癌患者的五年生存率没有显著改善，早期子宫内膜癌患者采用手术切除病灶，辅以化疗、放疗、激素或者靶向联合治疗，临床疗效尚可，但是对于诊断为子宫内膜癌晚期患者，由于其出现复发、转移，无法进行手术治疗，临床治疗疗效欠佳，五年生存率低于30%[3]。目前，子宫内膜癌复发转移的机制还未明确，探究子宫内膜癌增殖和恶性进展可能的分子机制，对子宫内膜癌的诊断和治疗具有重要意义。

驱动蛋白家族（Kinesin family，KIFs）是一组以微管为基础，具有运动结构域的蛋白质，作为细胞内转运蛋白，KIFs以三磷酸腺苷依赖的方式沿着微管定向运输各种物质，包括细胞器、蛋白质复合物和mRNA等。目前已发现和鉴定了45个KIF家族成员，不同的家族成员在肿瘤病理生物过程中表现出不同的功能[12]。其中KIF家族重要成员KIF18B在肿瘤中发挥促癌作用，与正常组织比较，KIF18B在恶性肿瘤组织中广泛上调，KIF18B高表达与肿瘤患者不良预后相关[13]。KE等[7]在乳腺癌和正常组织中鉴定出20个差异表达的KIF，其中KIF18B与乳腺癌患者生存期、无复发生存期和无远处转移生存期显著相关。与癌旁组织比较，KIF18B在前列腺癌组织中过表达，并且与较差的无病生存率相关[5]。KIF18B在宫颈癌组织中过度表达，并与大的原发性肿瘤直径、FIGO分期晚期和肿瘤高分级相关[10]。本研究检测子宫内膜癌组织中KIF18B的表达，结果显示与正常子宫内膜组织比较，KIF18B在子宫内膜癌组织中的阳性表达率更高，提示KIF18B与子宫内膜癌的发生有关。同时分析显示KIF18B在FIGO分期晚期和有淋巴结转移的子宫内膜癌组织中阳性表达率升高，表明KIF18B促进子宫内膜癌的发生发展。本研究生存分析显示KIF18B高表达的子宫内膜癌患者预后较差，这与KIF18B在前列腺癌和乳腺癌中的报道一致[5,9]，也提示KIF18B是子宫内膜癌预后不良的分子标志物。

文献显示，在前列腺癌细胞系中敲除KIF18B的表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭，并抑制细胞凋亡，可能是通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路发挥作用，这提高了KIF18B作为前列腺癌新生标志物的可能性[5]。在乳腺癌中，KIF18B通过上调甲状腺激素受体因子13的表达，激活Wnt/β-catenin信号通路发挥致癌作用[9]。为探索KIF18B在子宫内膜癌细胞中的生物学功能，本研究采用KIF18B siRNA转染子宫内膜癌细胞，同样敲减子宫内膜癌细胞中的结果显示子宫内膜癌细胞的增殖和转移能力降低，这与在前列腺癌和乳腺癌中KIF18B的报道一致，与本文KIF18B在FIGO分期晚期和有淋巴结转移的子宫内膜癌组织中阳性表达率升高的结果相符，表明KIF18B通过促进子宫内膜癌细胞增殖和转移能力促进子宫内膜癌恶性进展，可能是抗子宫内膜癌治疗的潜在分子靶点，但是其作用机制仍需进一步研究。

在先前的研究中显示在乳腺癌、宫颈癌和肝细胞肝癌中KIF18B均通过上调Wnt/β-catenin信号通路促进肿瘤的增殖和转移[9-11]。在Wnt经典途径中，Wnt激活并破坏β-catenin复合物，使β-catenin蛋白积累并随后转移到细胞核中，促进下游癌基因的表达，如c-Myc和cyclinD1，调控肿瘤的恶性进展[14]。在骨肉瘤中KIF18B通过减少激活转录因子2的核聚集或通过与结肠腺瘤样息肉病基因的相互作用，在转录后调节β-catenin蛋白的表达，显著促进骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[15]。Wnt/β-catenin信号通路也与子宫内膜癌的发生发展密切相关[16]，本研究结果显示干扰KIF18B的表达显著抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性。在乳腺癌中KIF18B敲除后可降低MMP2和MMP9蛋白表达水平，基质金属蛋白酶可以通过破坏细胞基质促进细胞的运动、转移能力，KIF18B敲除后降低了乳腺癌细胞中β-catenin，c-Myc和cyclin D1蛋白表达水平[9]。本文干扰子宫内膜癌细胞中KIF18B的表达后发现，Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt3a和β-catenin表达降低，其下游蛋白c-Myc，cyclinD1，MMP2和MMP7表达降低，表明KIF18B可能通过Wnt/β-catenin信号通路促进子宫内膜癌细胞增殖和转移。但Wnt/β-catenin信号通路的调控是错综复杂的，KIF18B是如何具体上调Wnt/β-catenin信号通路的分子机制本文未进行深入研究，为本文的不足之处，后续仍需进一步深入探讨。

综上所述，KIF18B在子宫内膜癌组织中高表达，与子宫内膜癌患者的FIGO分期、淋巴结转移及预后不良相关。KIF18B可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进子宫内膜癌细胞增殖和转移，有望成为子宫内膜癌治疗分子靶点。