原发性肝癌患者血清miR-196b和miR-520f表达水平及其临床诊断价值分析

齐 锐，王何斌，李 劲，杨茂辉，徐 杰（攀枝花学院附属医院肝胆科，四川攀枝花 617000）

原发性肝癌（primary hepatocellular carcinoma）作为临床常见的消化系统恶性肿瘤，其高发病率和死亡率已成为国家重要的公共卫生问题[1]。尽管近年来随着医学技术的发展，原发性肝癌的治疗取得很快的进步，但其术后复发率、死亡率仍然较高。因此，如何降低原发性肝癌术后死亡率成为当前临床面临的重要问题。既往有研究表明，微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）在肝癌早期诊断、预后监测及靶向治疗中发挥重要作用[2-3]。miR-196b，miR-520f均是miRNA家族成员之一，miR-196b具有参与肿瘤的淋巴结转移和细胞增殖等作用，研究显示miR-196b与头颈部鳞状细胞癌患者预后密切相关[4-5]；而miR-520f在多种恶性肿瘤中发挥抑癌基因作用，下调miR-520f表达水平不仅增强癌细胞的增殖作用，同时可作为诊断肺癌的生物标志物[6-7]。但目前关于血清miR-196b，miR-520f对原发性肝癌诊断价值的研究尚不清楚。因此，本研究探讨原发性肝癌患者血清miR-196b，miR-520f水平表达及临床诊断价值研究。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2020年6月～2022年6月经攀枝花学院附属医院收治的73例原发性肝癌患者作为研究组，其中男性30例，女性43例，年龄35～80（52.66±4.24）岁。同时选择同期在医院体检的80例健康人群作为对照组，其中男性32例，女性48例，年龄36～80（53.01±4.43）岁。纳入标准：①研究组患者均符合《原发性肝癌诊疗规范》中的诊断标准[8]；②所有研究对象及其家属均已签署知情同意书；③所有研究组患者均为初次诊治，术前未接受过化疗、放疗等治疗者。排除标准：①伴有重要脏器功能障碍者；②并发严重感染性疾病、免疫系统疾病、血液系统疾病以及其他恶性肿瘤疾病者；③伴有酒精性肝损伤、活动性肝炎等肝脏疾病者；④术前进行其他抗肿瘤治疗以及存在治疗禁忌症者；⑤既往有精神病史或存在认知功能障碍者；⑥临床资料不全者；⑦无法完全配合治疗或中途退出研究者。本研究经过医院伦理委员会审核批准。

1.2 仪器与试剂 NanoDr-ropND-1000（美国Thermo公司），Trizol试剂（北京索莱宝科技有限公司），TaqMan miRNA检测相关的试剂盒（美国，赛默飞公司），miRNeasy Mini检测相关的试剂盒（美国，通用公司），ABI7900型PCR仪（美国，ABI公司）。

1.3 方法 样本收集：获得本研究纳入患者知情同意后，于入院后次日清晨抽取空腹外周静脉血5 ml送检，室温下以2 500 r/min离心10 min，随后取上清液存放至-80 ℃冰箱内用于后续RNA提取及检测。总RNA提取：取出血清样本后按照提取Trizol试剂说明书提取血清中总RNA，应用NanoDrropND-1000测定RNA纯度，随后将提取出的RNA样品置于-80℃冰箱保存盒。实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（qRT-PCR）检测：采用miScript逆转录试剂盒将上述血清总miRNA合成cDNA，每10 μl逆转录作为一个反应体系。反应条件为95℃10 s，40个循环，90 ℃ 5 s，40个循环。并利用CFX manager 3.0软件对Ct值进行分析，再通过2-△△Ct法(△t=CtmiRNA-CtU6)计算血清miR-196b，miR-520f的相对表达量。

1.4 统计学分析 运用SPSS24.0进行统计学数据处理量，计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用成组设计资料的t检验；计数资料比较使用n(%)描述，采用χ2检验；采用Pearson相关性分析血清miR-196b与miR-520f的关系，采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析血清miR-196b，miR-520f对原发性肝癌的诊断价值。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 研究组、对照组血清miR-196b，miR-520f表达水平比较 研究组血清miR-196b表达水平明显高于对照组（2.73±0.56 vs 0.99±0.24），而miR-520f表达水平明显低于对照组（1.69±0.44 vs 3.34±0.64），差异具有统计学意义（t=30.578，12.690，均P<0.05）。

2.2 血清miR-196b，miR-520f表达与原发性肝癌临床病理特征的关系 见表1。原发性肝癌患者血清miR-196b，miR-520f表达水平与肿瘤直径、临床分期、分化程度、淋巴结转移对比，差异均有统计学意义（均P<0.05）。

表1 血清miR-196b，miR-520f表达与原发性肝癌临床病理特征的关系(±s)

表1 血清miR-196b，miR-520f表达与原发性肝癌临床病理特征的关系(±s)

类 别nmiR-196bt值P值miR-520ft值P值年龄（岁） ≥52333.30±0.711.4130.1621.62±0.381.1980.235<52403.37±0.621.75±0.46临床分期 Ⅰ～Ⅱ期483.02±0.616.334<0.0011.75±0.495.892<0.001Ⅲ～Ⅳ期253.95±0.921.57±0.31分化程度 中高分化453.06±0.536.919<0.0011.73±0.454.564<0.001低分化283.79±0.881.62±0.27淋巴结转移 无472.95±0.734.868<0.0011.76±0.283.873<0.001有264.05±0.781.56±0.13肿瘤直径（cm）≥5404.06±0.8013.229<0.0011.38±0.407.814<0.001<5332.47±0.602.06±0.54

2.3 原发性肝癌患者血清miR-196b与miR-520f表达的相关性 Pearson相关分析显示，原发性肝癌患者血清miR-196b表达水平与miR-520f表达水平呈负相关（r=-0.445，P=0.006）。

2.4 血清miR-196b，miR-520f对原发性肝癌的诊断价值 见图1。ROC曲线分析显示，血清miR-196b预测原发性肝癌的曲线下面积、截断值、敏感度、特异度及95%置信区间（95% confidence interval，95%CI）分别为0.842，2.55，91.78%，62.50%，95%CI（0.810～0.874）；miR-520f预测原发性肝癌的曲线下面积、截断值、敏感度、特异度及95%CI分别为0.872，2.43，91.78%，67.50%，95%CI（0.848～0.906）；血清miR-196b联合miR-520f预测原发性肝癌的曲线下面积、敏感度及特异度分别为0.923，86.30%，87.50%，95%CI（0.891～0.955）。

图1 血清miR-196b，miR-520f对原发性肝癌诊断ROC曲线

3 讨论

目前原发性肝癌的世界标准化发病率、死亡率分别为10.1/10万，9.5/10万[9]。原发性肝癌起病隐匿，恶化程度高，筛检率低，大部分患者确诊时经常已到中晚期，虽然国家原发性肝癌的治疗已取得显著进展，但总体发病率和死亡率尚无明显改善，因此进一步提高患者生存预后仍面临严峻挑战。因此，早发现、早诊断、早治疗是防治原发性肝癌的关键环节，其中甲胎蛋白、癌胚抗原、糖蛋白抗原199等生物标志物作为筛选原发性肝癌的重要指标，其敏感度、特异度均不高；部分原发性肝癌患者用上述指标检测无法确诊[10]。miRNAs作为一类具有19～22个核苷酸的内源性非编码单链RNA，能够调节细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移以及胚胎发育等多种生物学过程[11]。因此，本研究拟探讨原发性肝癌患者血清miR-196b，miR-520f表达水平及诊断价值。

越来越多的研究发现miRNA在肿瘤疾病中发挥促癌或抑癌等作用，并且与肿瘤的发生、转移、复发和预后密切相关[12]。miR-196b，miR-520f作为miRNA家族的成员，可参与肿瘤疾病的发生发展。miR-196b作为一种促癌基因，基因定位于人染色体7p15.2，可参与机体的生长发育等生物学过程[13]。近年已有相关研究发现，miR-196b在非小细胞肺癌预后不良患者中呈高表达，并可作为预测患者术后不良预后的分子标志物[14]；同时另一实验研究发现抑制miR-196b可能通过下调PI3K/Akt通路相关蛋白表达，从而降低宫颈癌细胞对顺铂的耐药性[15]。肖二辉等[16]人分析miR-196b靶向核凋亡诱导因子1（nuclear apoptosis-inducing factor 1，NAIF1）调控肝癌细胞生长和凋亡的机制，结果发现下调miR-196 b靶向负调控NAIF1表达抑制肝癌细胞生长并诱导凋亡。而miR-520f是一种肿瘤抑制因子，定位于19号染色体，具有调控胚胎干细胞生长分化，抑制肿瘤细胞恶性生物学行为的作用[17]。目前已有研究发现，miR-520f表达下调与非小细胞肺癌细胞恶性增殖、侵袭行为及非小细胞肺癌患者不良预后密切相关[18]。XU等[19]研究亦发现miR-520f和成纤维细胞生长因子16的过度表达与肝细胞癌患者的侵袭性表型和不良生存率呈正相关，miR-520f通过调节FGF16表达促进HCC侵袭性表型。因此，通过检测血清miR-196b，miR-520f含量可能在原发性肝癌的诊断中存在一定的临床价值。

因此，本研究对血清miR-196b，miR-520f分析，结果发现研究组血清miR-196b表达水平明显高于对照组，miR-520f表达水平明显低于对照组（P<0.05），说明原发性肝癌患者体内的miR-196b相对表达水平高于正常人，而miR-520f相对表达水平低于正常人，其原因可能是miR-196b高表达促进肿瘤细胞增殖及miR-520f在肿瘤中发挥抑癌作用有关。苗春木等[20]研究显示，胰腺癌组织 miR-196b表达上调，且可导致肿瘤恶性进展。CUI等[21]研究显示，miR-520f过表达可以抑制非小细胞肺癌的增殖、迁移和入侵。本研究结果显示，原发性肝癌患者血清miR-196b，miR-520f表达水平与肿瘤直径、临床分期、分化程度、淋巴结转移存在显著关系（均P<0.05），表明miR-196b表达上调及miR-520f表达下调均能够促进原发性肝癌恶性进展。Pearson相关分析显示，原发性肝癌患者血清miR-196b表达水平与miR-520f表达水平呈负相关（P<0.05）；说明血清miR-196b，miR-520f表达水平能够在一定程度上反映原发性肝癌发生、发展。ROC曲线分析显示，血清miR-196b预测原发性肝癌的曲线下面积、截断值、敏感度以及特异度分别为0.842，2.55，91.78%和62.50%，miR-520f预测原发性肝癌的的曲线下面积、截断值、敏感度以及特异度分别为0.872，2.43，91.78%和67.50%，提示血清miR-196b和miR-520f均可有效诊断原发性肝癌，且当机体外周血中miR-196b表达水平高于2.55，miR-520f表达水平低于2.43时，提示原发性肝癌发生风险较高。既往的研究显示，miR-196b作为一种促癌基因，其表达上调能够通过激活AKT信号通路，促进下游血管内皮生长因子等癌基因的表达，进而导致肿瘤发生发展[22]。因此本研究患者血清miR-196b表达水平升高可调节细胞增殖、迁移和侵袭，导致原发性肝癌发生发展。同时既往研究发现，下调miR-520f可减弱细胞凋亡抑制作用[23]，当本研究外周血miR-520f表达水平降低可导致机体肝癌细胞增殖、生长和侵袭能力提高，进而促进原发性肝癌发生发展。既往多项研究表明联合检测血清microRNA是一种有效的提高肿瘤诊断效能的新方法，因此本研究经ROC曲线分析发现，血清miR-196b联合miR-520f预测原发性肝癌的曲线下面积优于单一血清miR-196b，miR-520f，证实临床联合检测血清miR-196b和miR-520f是能够更有效提高原发性肝癌诊断效能的有效方法，可为临床治疗以及预后评估提供更及时的参考依据。

综上所述，原发性肝癌患者血清miR-196b表达水平上调，miR-520f表达水平下调，其表达水平与原发性肝癌肿瘤直径、临床分期、分化程度、淋巴结转移密切相关，且联合检测血清miR-196b和miR-520f能有效提高原发性肝癌的诊断效能。但本研究为回顾性，单中心样本分析，且未分析血清miR-196b和miR-520f与患者预后的关系，因此更多结论需在今后的研究中进一步分析。