急性缺血性脑卒中患者血浆LIPCAR和MMP-9水平与病情严重程度及溶栓治疗后认知功能的关系研究

郭继勃，钟 曌，郭 昊，韩晓婷，祝 刚，孙世辉，任佳封（1.空军军医大学第二附属医院a.急诊科；b.神经内科；c.神经外科，西安 710038；.核工业四一七医院神经内科，西安 710699）

急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke，AIS)是一类临床上常见的脑血管疾病，具有较高的发病率、致残率和病死率，已成为全球危害人类健康的主要原因之一[1]。目前，重组组织型纤溶酶原激活剂( recombinant tissue plasminogen activator，RTPA) 静脉溶栓法是改善AIS结局最有效的药物治疗手段，但大多数患者由于未能及时送医或存在个体代谢差异，导致AIS患者溶栓治疗的比例仍较低[2]。因此，寻找由脑缺血引发的特异性表达分子，将可能成为AIS疾病诊断和预后评估的重要指标。长链非编码RNA预测心脏重构（long noncoding RNA predicting cardiac remodeling，LIPCAR）是近年发现来源于DNA线粒体，与左心室重塑相关性最高的线粒体长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA），研究发现其不仅与人类肿瘤的发生发展相关，还参与了炎症反应、氧化应激、血管生成及细胞自噬、凋亡等病理过程，在多种心血管疾病中异常表达，与心肌梗死、心力衰竭、脑梗死及冠状动脉疾病的发生关系密切[3-6]。而LIPCAR在AIS中的表达及作用尚不清楚，且研究报道鲜少。另一方面，基质金属蛋白酶9（matrix metalloprotein9，MMP-9）是基质金属蛋白酶家族中的重要成员之一，研究证实其参与了血脑屏障通透性及神经细胞损伤的调节[7]。在脑缺血灌注损伤中MMP-9发挥重要作用，下调其水平可以阻止脑核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)/p65信号通路的激活，减少炎症反应，从而减轻血脑屏障损伤[8]。然而LIPCAR，MMP-9是否能作为AIS疾病诊断和预后评估的潜在因子尚不清楚。因此本研究通过检测AIS患者血浆LIPCAR和MMP-9水平，分析两者表达与AIS患者病情严重程度及与RT-PA治疗后神经认知功能恢复的相关性，旨在为AIS的诊断及改善患者预后提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2019年8月～2021年12月在空军军医大学第二附属医院神经内科确诊且行RT-PA静脉溶栓治疗的90例AIS患者为病例组。纳入标准：①AIS患者符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018版》诊断标准[9]，并经影像学首次确诊；②发病时间在4.5 h内；③所有患者接受RT-PA静脉溶栓治疗；④所有研究对象年龄应大于18岁，小于80岁。排除标准：①并发有心、肾、肝等严重功能器官损伤者；②并发其他恶性肿瘤者； ③并发头部外伤、颅内出血者；④并发有意识障碍或精神疾病者；⑤既往有颅内心脑手术史者。同时选取于本院体检中心进行体检的58例健康者为对照组，两组患者在年龄、性别、BMI，吸烟史、饮酒史、糖尿病、高血脂、房颤病、冠心病史差异无统计学意义（t/χ2=0.453，0.052，-0.269，0.101，0.063，0.222，0.463，0.124，0.328，均P>0.05）。本研究经本院伦理委员会审核批准，所有研究对象均知情并签署同意书。

1.2 仪器与试剂 RT-PA静脉溶栓治疗（注射用阿替普酶，德国 Boehringer Ingelheim 公司）；MMP-9检测酶联免疫法试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；全自动生化分析仪（型号AU5800，美国贝克曼库尔特公司）；酶免检测仪（型号BIOBASE2000，山东博科生物产业有限公司）；酶联免疫检测试剂盒（美国Epitope Diagnostics公司）。

1.3 方法

1.3.1 临床资料收集：所有研究对象均于入院后记录其年龄、性别、身高、体重、收缩压、舒张压等基本资料，并于入院第二天清晨空腹抽取静脉血，检测红细胞计数、红细胞比积、白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、单核细胞计数、血小板计数等细胞检测及空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、血清肌酐（serum creatinine，Scr）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转氨酸（aspartate aminotransferase，AST）及同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）等生化指标。

1.3.2 外周血LIPCAR，MMP-9水平检测：入院治疗前，采集所有受试者空腹静脉血5 ml，置于抗凝管内，在4 ℃条件下，3 500 r/min离心10 min，取上清液保存备用。采用酶免检测仪检测血清LIPCAR和MMP-9水平，操作严格按照试剂盒说明书进行检测。

1.3.3 AIS神经功能缺损程度评估：入院后根据美国国立卫生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）对AIS患者进行神经功能缺损程度评分，其量表主要包括对意识、语言、运动、感觉、共济运动、眼球运动、视野等方面的评判，评分为0～42分，分数越高表明神经功能缺损越严重，卒中程度越重。

1.3.4 RT-PA静脉溶栓治疗后认知功能的评估：所有患者入院后予以RT-PA静脉溶栓治疗，使用剂量按照0.9 mg/kg，最大控制剂量为90 mg，前10 min静脉缓慢推注总剂量的10%，余量在1 h内静脉输注完成，每天2次，治疗7天后，依照蒙特利尔认知评估量表（Montreal cognitive assessment，MoCA）对其认知功能进行评分，主要评分内容包含有注意与集中、执行功能、记忆力、语言功能、视空间技能、抽象思维、计算和定向力等8个认知领域，总分30分，受教育年限≤12年加1分，＜10分为重度认知障碍，10～17分为中度认知障碍，18～25分为轻度认知障碍，≥26分为认知功能正常。根据MoCA评分将AIS患者分为认知功能恢复良好者（MoCA≥26分）和认知功能恢复不良组（MoCA＜26分）。

1.4 统计学分析 应用SPSS 24.0统计软件进行数据分析，计数资料以n（%）表示，采用χ2检验；服从正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；偏态分布计量资料以中位数（四分位间距）[M(IQR)]表示，行非参数检验；采用Pearson相关分析法分析LIPCAR和MMP-9表达相关性及两者分别与AIS严重程度、RT-PA静脉溶栓治疗后认知功能的相关性；Logistic回归模型分析影响AIS神经功能恢复的危险因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AIS组和对照组血浆LIPCAR，MMP 9水平及临床资料比较 见表1。AIS组患者高血压史、收缩压、白细胞数、单核细胞数、血小板数，FBG，SCr，ALT，Hcy，LIPCAR和MMP-9水平及入院NIHSS评分明显高于对照组，经χ2或独立样本t检验差异均有统计学意义（t/χ2=4.137～19.150，均P＜0.05），其它指标组间差异未见明显统计学意义（t/χ2=-0.269～1.115，均P＞0.05）。

表1 AIS组和对照组血清LIPCAR，MMP-9水平及临床资料比较[n(%)，x ±s]

2.2 RT-PA治疗后认知功能恢复良好组和不良组LIPCAR，MMP 9及MoCA评分 见表2。AIS患者RT-PA治疗7天后进行MoCA评分，53例（58.89%）患者认知功能恢复良好，37例（41.11%）患者认知功能恢复不良。恢复良好组和恢复不良组LIPCAR，MMP-9水平明显高于对照组，且恢复良好组水平显著低于恢复不良组，差异具有统计学意义（t=5.956～28.655，均P＜0.05）；恢复不良组MoCA评分明显低于恢复良好组和对照组，差异有统计学意义（t=20.572，23.115，P＜0.05），恢复良好组和对照组差异无统计学意义（t=2.401，P＞0.05）。

表2 RT-PA治疗后认知功能恢复良好组和不良组LIPCAR，MMP-9水平及MoCA评分比较（x ±s）

2.3 LIPCAR，MMP 9水平与AIS严重程度、RTPA溶栓后MoCA评分的相关性 Pearson相关分析显示，AIS患者血清LIPCAR，MMP-9水平呈正相关(r=0.657，P＜0.05)，其两者分别与入院NIHSS评分呈正相关(r=0.602，0.715，均P＜0.05)，与RT-PA溶栓治疗后MoCA评分呈负相关(r=-0.596，-0.647，均P＜0.05)。

2.4 RT-PA治疗后认知功能恢复良好组和不良组临床资料比较 见表3。认知功能恢复良好组和不良组糖尿病、高血脂、高血压比例及FBG，Hcy水平和入院NIHSS评分差异均有统计学意义（t/χ2=-10.001～4.982，均P<0.05），两组其他资料组间差异无统计学意义（t/χ2=-1.902～1.536，均P>0.05）。

表3 RT-PA治疗后认知功能恢复良好组和不良组临床资料比较[n(%)，x ±s]

2.5 影响AIS患者RT-PA治疗后认知功能恢复的危险因素分析 见表4。以上述结果中认知功能恢复良好组和不良组存在统计学差异的指标作为自变量，认知功能恢复情况作为因变量，进行Logistic回归分析，结果显示糖尿病、高血脂、高血压、FBG，Hcy，LIPCAR，MMP-9水平及入院NIHSS评分均是影响AIS患者RT-PA治疗后认知功能恢复的独立危险因素，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表4 影响AIS患者认知功能恢复的多因素Logistic回归分析

3 讨论

AIS发生的主要原因是局部脑组织因血流循环障碍缺血、缺氧发生的脑组织软化、坏死，造成临床上神经功能缺失表现[10]。故治疗AIS的首要任务是恢复血液流动，减少血流中断引起的神经元细胞死亡，促进神经细胞功能修复。RT-PA静脉溶栓治疗是目前国内外指南推荐治疗超早期AIS的主要手段，但在临床中由于不同患者的脑血流量存在差异，并结合患者的发病时间、颅内出血等多种因素，导致部分患者溶栓治疗后出现血管再闭塞、神经缺损严重及认知功能障碍等发生[11]。因此寻找能反映AIS病情严重程度及RT-PA静脉溶栓治疗后认知功能恢复情况的检测因子，对于临床提高RT-PA静脉溶栓治疗效果及改善患者预后具有重要意义。

近年随着RNA测序技术的发展，研究发现LncRNAs不仅参与肿瘤的发生发展，还在AIS引发的多种生物过程中发挥调节作用[12]。CHEN等[13]研究表明，LncRNAs改变与调控神经元病理、生理过程的多个信号通路失调有关。基于AIS动物模型和临床的多个研究表明，LncRNAs表达谱在AIS中显著变化，能够调节脑损害后神经细胞凋亡、血管生成及神经炎症等病理过程[14-15]，提示其具有作为AIS药物治疗靶点及临床生物标志物的潜力。LIPCAR是KUMARSWAMY 等[16]人利用LncRNA芯片技术检测发现来源于线粒体DNA，可用于预测心脏重塑的基因间长链非编码RNA，在外周血中较易检测到。近年研究报道，LIPCAR在心力衰竭、心肌梗死、冠状动脉粥样硬化相关的冠心病等多种心血管疾病患者血浆中表达显著升高，与心力衰竭患者左心室重构和不良预后相关，可作为新的心脏重构生物标志物预测心力衰竭的死亡风险，且是ST段抬高型心肌梗死患者不良心血管事件及冠状动脉疾病的独立预测因子[3,5-6,17]。然而LIPCAR与AIS发生的关系目前尚不明确，因此本研究探讨了LIPCAR在AIS中的表达变化及与患者神经功能缺损严重程度和认知功能恢复的关系，发现AIS患者LIPCAR表达显著高于对照组，提示LIPCAR与AIS的发生相关。Pearson相关性显示，LIPCAR与入院NIHSS评分呈正相关，推断LIPCAR可能通过调控线粒体通路，导致线粒体功能紊乱，进而导致中枢神经细胞受损，加重AIS疾病发展。RT-PA静脉溶栓治疗后，认知功能恢复良好的患者LIPCAR水平明显较低，LIPCAR水平与MoCA评分呈负相关，LIPCAR高表达是影响AIS患者认知功能恢复的危险因素，说明LIPCAR高表达可引起AIS患者不良预后。

MMP-9以酶原的形式从胞内分泌到胞外，可以降解脑血管基底膜的主要成分，包括IV型胶原蛋白、层黏连蛋白和纤连蛋白，在中枢神经系统的病理和生理过程中起重要作用[7,18]。相关研究表明，原代小胶质细胞中MMP-9表达上调，白藜芦醇通过下调MMP-9表达可抑制小胶质细胞炎性因子的释放，改善神经元功能障碍，保护缺血性脑损伤[19]。目前MMP-9与AIS的关系已获得大量研究证实，发现MMP-9异常表达与血脑屏障破坏、颅内出血有关，是AIS发生和预后不良的危险因子[7]。相关研究也报道，MMP-9与AIS患者RT-PA静脉溶栓后神经功能缺损显著相关[20]。而本研究探究MMP-9表达与AIS神经功能缺损严重程度和静脉溶栓治疗后认知功能恢复的关系，发现AIS外周血MMP-9含量显著高于对照组，与既往文献报道相吻合。同时发现MMP-9水平与入院NIHSS评分呈正相关，提示MMP-9与患者神经缺损正相关，可能原因是MMP-9表达升高增加了细胞外基质降解，加剧血脑屏障通透性，导致患者脑水肿和出血。常青等[21]报道，AIS血清MMP-9表达增强可作为静脉溶栓后出血转化发生的独立危险因素。本研究发现MMP-9水平与RT-PA治疗后神经认知功能恢复呈负相关，因素分析也提示MMP-9是AIS认知功能恢复的独立危险因素。且AIS外周血LIPCAR和MMP -9表达水平呈正相关，猜测两者可能协同作用参与了AIS的发病，然而具体的作用机制还需进一步探究。既往LIPCAR与疾病的报道多为基因水平研究，本研究基于血液水平检测对LIPCAR在AIS中的表达及与神经功能缺损严重程度和认知功能恢复的关系进行了初步探讨，检测方法简便，为AIS临床诊断、指导治疗及评估预后提供了价值参考。但本研究样本量有限，LIPCAR表达检测方法单一，结果未能相互验证，且缺乏对作用机制方面的探讨，故仍需行进一步的深入研究。

综上所述，LIPCAR，MMP-9在AIS患者外周血中含量显著增加，与患者病情严重程度相关；经RT-PA静脉溶栓治疗后，LIPCAR，MMP-9水平与患者认知功能恢复呈负相关，且是影响患者认知功能恢复的危险因素之一，可为预测临床预后提供参考依据。