不同成熟度鲜烟素质对烤后烟叶品质贡献度的研究

胡永涛， 汪代斌， 陈益银， 杨超， 郑林林， 史宏志， 王建安*

（1.河南农业大学烟草学院，郑州 450002； 2.中国烟草总公司重庆市公司，重庆 404100）

鲜烟采收成熟度是烟叶在田间生长发育和干物质积累到适于调制加工的质量状态和程度，对烟叶烘烤的难易程度有较大的影响，同时也是提高烤后烟叶品质的必要条件[1]。不同成熟度烟叶的鲜烟素质差异较大，会影响烤后烟叶的品质。鲜烟素质是烟叶自身具备的特征特性，主要体现在组织结构、色素含量、酶活性、化学成分含量等方面[2]。鲜烟素质是田间烟叶成熟的基础，因此，与成熟度具有对应关系。陈颐等[3]、刘辉等[4]研究表明适熟烟叶烤后质量最佳，然后反推适熟烟叶的植物学特性指标，得到了成熟度判断标准。徐兴阳等[5]研究了烟叶成熟度与鲜烟叶特征间的关系，得到了适宜采收的成熟度。高宪辉等[6]研究表明，可通过颜色值及其判别函数来判别烟叶的成熟度。张冰濯等[7]研究表明，SPAD 值可作为烟叶采收成熟度的判断标准。这些研究大多通过烤后烟叶品质来反推鲜烟叶成熟度的植物学特征，罗列不同成熟度鲜烟素质的指标来确定采收成熟度的判断标准，但对不同鲜烟素质指标影响烤后烟叶品质的贡献度并不明确。偏最小二乘法-判别分析（partial least squares discriminant analysis,PLS-DA）属于有监督分析，通过预设分类尽可能去除未控制变量对数据造成的影响，进一步挖掘数据信息，量化特征物质造成样品之间差异的程度[8]。因此，本研究通过PLS-DA 分析不同成熟度鲜烟素质特征指标对烤后烟叶品质影响的贡献度大小，为烟叶成熟度判断标准的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料和地点

试验于2019—2020 年在重庆市巫溪县古路镇黄阳村（海拔992.99 m，E 109°22′55″，N 31°18′50″）进行，土壤类型为沙壤土，地势平坦，肥力适中。供试烤烟品种为‘渝金香1号’，田间采用标准化规范管理。

1.2 试验设计

试验按照烟叶外观特征设置3 个成熟度，各成熟度鲜烟叶采收特征如表1 所示。各处理分别选取具有代表性的9 片鲜烟叶（中部叶：10~12 叶位）用于测定每片烟叶的色素含量、组织结构和主要酶活性等指标，3次重复。每个成熟度选取5竿样烟进行烘烤试验，烘烤时置于同一烤房中层，按照当地常规烘烤工艺进行烘烤。烘烤结束后，对烤后烟叶进行外观质量评价、化学成分检测和感官质量评吸。

表1 田间鲜烟叶采收特征Table 1 Harvest characteristics of fresh tobacco leaves in the field

1.3 测定指标及方法

1.3.1叶片生理指标的测定 各处理取中部鲜烟叶（10~12 叶位），在叶片第5~8 支脉之间，距主脉左右两侧3 cm 处用8 mm 打孔器取样，样品混合均匀后用于叶绿素a（chlorophyll a，CA）、叶绿素b（chlorophyll b，CB）、类胡萝卜素（carotenoid，CD）、总叶绿素含量（total chlorophyll，TC）、类叶比（ratio of carotenoids to chlorophyll，RCC）、丙二醛含量（malondialdehyde，MDA）、过氧化物酶（peroxidase，POD）活性、超氧化物歧化酶（superoxide Dismutase，SOD）活性和总淀粉酶（total amylase，TA）活性共8 项指标的测定。其中，色素和MDA 含量及POD 和SOD 活性的测定采用分光光度法[9]；总淀粉酶活性采用3, 5-二硝基水杨酸比色法测定[10]。

1.3.2叶片组织结构石蜡切片的制备 对田间鲜烟叶沿着叶片中部至尖部中央段两侧距主脉2～3 cm 进行打孔取样（图1），将取下的叶片样品用福尔马林-乙酸-乙醇 （formalin-aceto-alcohol，FAA）固定液（70%酒精）固定保存。按照常规石蜡切片法[11]进行切片，采用番红-固绿染色。使用Eclipse Ci-L 拍照显微镜选取叶片组织的目的区域进行100 倍成像。成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0 分析软件测定各部分数据。主要包括叶片厚度（thickness of leaf，TL）、上表皮厚度（thickness of upper epidermis，TUE）、下表皮厚度（thickness of lower epidermis，TLE）、栅栏组织厚度（thickness of palisade tissue，TPT）和海绵组织厚度（thickness of spongy tissue，TST），并计算组织比（tissue ratio， TR），公式如下。

图1 鲜烟叶取样点Fig.1 Sampling point of fresh tobacco leaves

组织比=栅栏组织厚度/海绵组织厚度 （1）

1.3.3烤后烟叶常规化学成分测定 取不同成熟度C3F 烤后烟叶2 kg，于65 ℃条件下烘干并粉碎研磨，采用孔径为0.25 mm 的滤筛过滤。参考张炳辉等[12]的方法，使用连续流动法测定烤后叶片的总糖、还原糖及钾、氯、烟碱和总氮含量，并计算氮碱比、糖碱比和钾氯比。

1.3.4烤后烟叶外观质量评价 由专业分级的技术人员按照GB 2635—1992 烤烟分级标准[13]进行外观质量评价，包括：颜色、成熟度、结构、身份、油分和色度。

1.3.5烤后烟叶感官质量评价 由河南中烟技术中心专家按照YC/T 138—1998 标准[14]进行评价。包括：香气质、香气量、浓度、刺激性、杂气、余味。

1.4 数据分析

运用Excel 2016 软件进行数据的初步统计，运用SPSS 22.0 进行差异显著性分析，运用Origin 2021进行PLS-DA分析及图表绘制。

2 结果与分析

2.1 不同成熟度鲜烟色素含量变化

由表2 可知，随着烟叶成熟度的提高，叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量逐渐降低，且不同成熟度之间存在显著差异；而类叶比逐渐增加，其中，适熟和过熟烟叶的类叶比显著高于尚熟烟叶，但适熟和过熟烟叶间差异不显著。

表2 不同成熟度鲜烟叶色素含量Table 2 Pigment contents of fresh tobacco leaves with different maturity

2.2 不同成熟度鲜烟叶组织结构差异

随着成熟度的增加，烟叶的组织结构呈现由紧密到疏松的变化趋势（表3 和图2）。尚熟叶片的厚度显著大于适熟和过熟叶片，而适熟与过熟间差异不显著。适熟烟叶的上表皮厚度显著大于尚熟烟叶；而过熟烟叶与尚熟和适熟间均差异不显著。适熟和过熟烟叶的栅栏组织厚度显著大于尚熟烟叶。3 个成熟度鲜烟叶的下表皮厚度、海绵组织厚度及组织比无显著差异。

图2 不同成熟度鲜烟叶组织结构Fig. 2 Tissue structure of fresh tobacco leaves with different maturity （100×）

表3 不同成熟度鲜烟叶的组织结构Table 3 Tissue structure of fresh tobacco leaves with different maturities

2.3 不同成熟度鲜烟叶主要酶活性

由图3可知，随着烟叶成熟度的增加，MDA含量显著增加，表现为过熟>适熟>尚熟；叶内SOD和POD 活性显著降低，表现为尚熟>适熟>过熟；总淀粉酶活性先升高后降低，表现为适熟>过熟>尚熟，且各处理间差异显著。

图3 不同成熟度鲜烟叶酶活性Fig. 3 Enzyme activity of fresh tobacco leaves with different maturity

2.4 烤后烟叶常规化学成分分析

不同成熟度烤后烟叶的化学成分如表4 所示。随着烟叶成熟度的增加，烟叶中总糖、还原糖、钾离子含量无显著变化；过熟烟叶的氯离子含量显著高于适熟和尚熟烟叶；尚熟烟叶的烟碱含量显著高于适熟烟叶，而过熟烟叶的烟碱含量与尚熟和适熟烟叶差异不显著；适熟烟叶的氮碱比和糖碱比显著高于尚熟和过熟烟叶。不同成熟度烟叶的钾氯比差异不显著，但适熟烟叶的钾氯比为4.13，更接近优质烟叶[15]。

表4 不同成熟度烤后烟叶化学成分Table 4 Chemical composition of flue-cured tobacco leaves with different maturity

2.5 不同成熟度烤后烟叶外观品质

不同成熟度烤后烟叶外观品质评价如表5 所示，随着成熟度的提高，‘渝金香1号’烤后烟叶外观品质的综合评价得分呈先升高后降低趋势，表现为适熟>过熟>尚熟，且不同成熟度间差异显著。其中，适熟烟叶烤后颜色较好、成熟充分、结构尚疏松、身份适中、油分足，色度强，外观品质较好。

表5 不同成熟度烤后烟叶外观品质评价Table 5 Evaluation of appearance quality of flue-cured tobacco leaves with different maturity

2.6 不同成熟度烤后烟叶感官质量

不同成熟度烤后烟叶的感官质量评价如表6所示，其中，适熟烟叶烤后的香气质、香气量、浓度、劲头、余味显著优于尚熟和过熟烟叶，且评吸得分显著高于尚熟和过熟烟叶。由此表明，适熟烟叶烤后香气质较好、香气量充足、浓度丰裕、劲头适中、刺激性较小、杂气较少、余味舒适，表现出更优的感官品质。

表6 不同成熟度烤后烟叶感官质量得分Table 6 Sensory quality scores of flue-cured tobacco leaves with different maturity

2.7 鲜烟素质指标的回归分析

回归分析能够反映不同成熟度鲜烟素质指标对烤后烟叶外观质量和感官质量的影响，回归系数为正值，代表该指标与外观质量和感官质量呈正相关，反之呈负相关。由图4 可知，叶片厚度、下表皮厚度、海绵组织厚度、组织比、叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量与烤后烟叶外观质量和感官质量呈负相关；上表皮厚度、栅栏组织厚度、类胡萝卜素含量与烤后烟叶外观质量和感官质量呈正相关；类叶比与外观质量呈正相关，与感官质量呈负相关关系。其中，上表皮厚度、栅栏组织厚度和叶绿素b 含量对烤后烟叶外观质量和感官质量影响较大。

图4 鲜烟素质指标对烟叶外观质量和感官质量回归系数图Fig.4 Regression coefficient diagram of fresh tobacco quality index on tobacco appearance quality and sensory quality

2.8 不同成熟度的鲜烟素质对烤后烟叶品量的影响

为进一步分析鲜烟素质指标对烤后烟叶质量贡献度的大小，通过PLS-DA 模型下的变量重要性因子（variable importance in the projection，VIP）对其进行排序，筛选出VIP>1 的因子作为代表性差异指标，结果如图5 所示。共获得了5 个VIP>1的鲜烟素质指标，分别为栅栏组织厚度（VIP=1.31）、上表皮厚度（VIP=1.24）、组织比（VIP=1.22）、下表皮厚度（VIP=1.09）和类叶比（VIP=1.05）。这5个鲜烟素质指标对烤后烟叶的品质影响较大。因此，在采烤前，可通过这些指标的鉴定来确定适宜采收的成熟度，进而提高烤后烟叶品质。

图5 不同鲜烟素质的 VIP值Fig. 5 VIP values for different fresh tobacco qualities

3 讨论

不同成熟度烟叶的色素含量、组织结构和相关酶活性等指标差异显著[16]。本研究结果表明，随着烟叶成熟度的提高，烟叶的叶绿素和类胡萝卜素含量逐渐减少，类叶比逐渐增大；叶片厚度逐渐降低，上表皮和下表皮厚度、栅栏组织厚度及组织比先升高后降低；MDA 含量显著增加，SOD 和POD 活性显著下降，总淀粉酶活性先升高后降低，与前人研究结果一致[17-20]。

鲜烟素质的差异是不同成熟度烟叶的内在反映，且影响调制后烟叶的品质[21]。光合色素含量不仅影响鲜烟叶的采收成熟度，也是影响烤后烟叶外观质量的重要因素[22]。疏密适中的组织结构有利于烟叶内理化成分的充分转化，是形成优质烟叶的基础[23]。MDA 含量的高低反映了细胞膜脂过氧化水平[24]，SOD 在生物抗氧化系统中具有重要作用[25]，各种酶活性的不同反映了烟叶细胞生理生化反应和内含物降解转化的程度不同，进而影响烟叶最终品质的形成。本研究结果表明，适熟烟叶烤后的化学成分更为协调，外观质量和感官质量均显著优于尚熟和过熟烟叶；上表皮和下表皮厚度、栅栏组织厚度、组织比和类叶比5 个鲜烟素质指标对烤后烟叶品质影响较大（VIP>1）。其中，下表皮厚度、组织比与烤后烟叶的外观质量和感官质量呈负相关；上表皮厚度、栅栏组织厚度与烤后烟叶外观质量和感官质量呈正相关；类叶比与外观质量呈正相关，与感官质量呈负相关。研究表明，上、下表皮厚度影响烘烤过程中烟叶的水分迁移和烤后烟叶身份[26]，但具体机理还有待进一步研究；栅栏组织的厚度反映了植物保水性、适应性的强弱，栅栏组织越厚，光能利用率越高[27]。适熟烟叶的栅栏组织较厚，光合效率高，因此，内含物较为充足，烤后烟叶品质较好。叶片紧密度与组织比呈正相关关系，而叶片紧密度影响烟叶的调制。类叶比在一定程度上可以代表烟叶的变黄程度[28]，因此，对烟叶外观质量影响较大。综上所述，不同成熟度鲜烟素质指标与烤后烟叶品质间关系密切，本研究筛选出5 个对烤后烟叶品质影响较大的鲜烟素质指标，为烟叶成熟度判断标准的选择和烤后烟叶品质的提升提供了理论依据，对烟叶的适时采收、提高烤后烟叶品质具有重要意义。