大耳白兔骨髓间充质干细胞的分离培养与生物学鉴定

周世莹， 刘晏辰， 张洋， 杨雪松， 关伟军， 高扬*

（1.首都体育学院体育教育训练学院，北京 100191； 2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193）

干细胞的应用前景不断扩大，其体外多向分化潜力、造血功能、促进移植、免疫调节和自我复制的优势也引起了人们的重视[1-2]。间充质干细胞最初在骨髓中分离鉴定出来，骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层[3-6],具有自我复制和多向分化潜能。间充质干细胞可以在体内或体外的特定环境中被诱导分化成脂肪、骨骼、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝脏、心脏、皮肤等多种细胞，即使是经过长期的培养和冷冻保存，依然具备多向分化的潜力，可以作为一种优质的种子细胞，用来治疗、修复、补充受损或缺损的肝、肌肉、以及衰老和病变所致的组织器官损伤[7-9]。随着干细胞技术越来越成熟，其能够再造一种全新的、正常的甚至更年轻的的细胞、组织和器官[10-11]。由于间充质干细胞来源广泛，易于分离培养，并且具有较强的分化潜能和自体移植等优点，研究者认为其是不久即将被引入临床治疗的最优干细胞[12-14]。日本大耳白兔是常用的试验动物，其BMSCs 方便采集，易于培养，适合生物学特性研究和应用[5,15-17]。本研究以日本大耳白兔BMSCs为材料，采用全骨髓贴壁法进行分离培养和多功能分化研究，建立日本大耳白兔BMSCs 细胞系及鉴定技术平台，为利用BMSCs 进行组织工程研究和动物遗传资源的保存提供参考，同时也为干细胞疗法和干细胞应用技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1试验动物 日本大耳白胎兔1 周龄，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所实验基地提供。

1.1.2主要试剂与仪器 DMEM/F12、L-DMEM、胎牛血清FBS、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)、地塞米松、DAPI染色液、ITS均购自美国Gibco 公司；抗坏血盐酸、β-甘油磷酸、L-脯氨酸、吲哚美辛、Ⅰ胰岛素、IBMX、油红O、V 型胶原酶、胰蛋白酶、Triton X-100 均购自美国Sigma 公司；HGF、Bfgf 均购自美国Peprotech 公司；RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 购自TaKaRa 公司；茜素红染液、冰醋酸、无水甲醇、多聚甲醛均购自北京化学试剂公司；山羊封闭血清、FITC标记山羊抗兔二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司；阿利新蓝购自北京中衫金桥生物有限公司；Trizol 购自美国invitrogen公司；100×青霉素、100×链霉素均购自北京索莱宝公司；CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD45 抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司；Giemsa染液购自北京佳辰科技有限公司。HF100 37.5 ℃ 5% CO2培养箱，德国Heraeus公司；DL-CJ-2N 高性能无菌实验台，中国哈尔滨东联电子技术开发有限公司；TDZS-WS 多管架自动平衡离心机，中国上海精宏实验仪器设备有限公司；1-15K 高速离心机，美国Sigma 公司；电子分析天平BS124S，德国赛多利斯；IX-71 倒置显微镜、CX31 生物显微镜、体视显微镜OLYMPUS SZ61，日本Olympus公司。

1.2 日本大耳白兔BMSCs的体外分离培养

1.2.1细胞分离 胎兔全身用75%乙醇消毒，放置在无菌操作台解剖，取其脊椎放置于含有1×青霉素、链霉素的PBS中，浸泡1 min后转移至超净工作台拿出脊椎，用含5×双抗的PBS 连续清洗5~10 次，放入60 mm 的无菌培养皿，用无菌镊子和眼科剪将脊椎周围的结缔组织、肌肉等剔除干净，用微型注射器将脊椎椎体的骨髓腔冲至无菌培养皿中，然后将冲出的骨髓液用离心管收集，1 2000 r·min-1下离心5 min，弃上清液。

1.2.2细胞培养 将上述分离的细胞用完全培养基（DMEM/F12 培养基、14% FBS、10 ng·mL-1Bfgf）重悬，接种于60 mm 细胞培养皿中，将余下的脊椎椎体用眼科剪剪碎，采用全骨髓贴壁法置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养[11]。接种1 周后细胞密度在80%~85%时进行换液传代，用PBS 连续清洗1~2 次，0.25%胰酶消化，在倒置显微镜下观察细胞是否脱落，可以轻轻拍打，之后用完全培养基终止消化，以1∶2 传代至新的60 mm 无菌培养皿，标记为P1 代，培养4 代细胞逐渐纯化。

1.3 日本大耳白兔BMSCs的细胞冻存与复苏

细胞冻存：用显微镜观察法测定，当细胞生长密度在90%~95%时进行消化，2 min后加入1 mL终止消化液(DMEM/F12培养基、15% FBS)，把15 mL离心管置于水平离心机，1 200 r·min-1离心8 min，用细胞计数板计算细胞总数，使用完全培养基稀释调整细胞密度为1×105cell·mL-1，加入1 mL 细胞冻存液(DMEM/F12 培养基、10% DMSO、40% FBS)至冻存管中，梯度降温存储(4 ℃ 1 h，-80 ℃ 24 h，液氮长期)。

细胞复苏：从液氮中取出需要的细胞冻存管，快速在37 ℃水浴锅解冻，1~2 min 后用75%乙醇消毒，然后在超净工作台中操作，加入4~5倍完全培养基，1 200 r·min-1离心10 min，弃掉上清液，加入DMEM/F12 完全培养基重悬细胞，根据细胞数量和活力调整细胞密度，接种培养至60 mm 无菌培养皿中[16]。在倒置式显微镜下，观察培养传代BMSCs细胞形态、贴壁状况并记录拍照。

1.4 日本大耳白兔BMSCs 不同代次的生长动力学检测

分别选取代次为5（P5）、10（P10）、15（P15）的细胞，用显微镜观察法测定，当密度达到80%~90%时常规消化收集细胞于15 mL 离心管，绘制生长曲线。①用血球计数板计数，使用完全培养基稀释调整每孔的细胞密度在1.0×104cell·mL-1；②把细胞接种于24 孔板，2 mL 完全培养基，放置培养箱培养；③培养24 h后随机选取3孔P5、P10、P15 细胞用血球计数板计算细胞数，为防止数值偏差每次取3 个孔取其平均值，连续7 d 计算细胞数量、根据数值绘制曲线，用公式（1）计算群体倍增时间（pupolation doubling time, PDT）[16]。

式中，to为起始时间；t为终止时间；N0为初始细胞个数；Nt为终止细胞个数。

1.5 日本大耳白兔BMSCs 划痕试验及克隆形成能力检测

为研究细胞的迁移运动和修复能力，采集P5代细胞，待细胞密度至90%~99%时，用200 µL 的枪头尖在细胞皿中快速从左到右垂直划3 次痕，枪头保持垂直于培养皿，PBS 清洗3 次除去被划去的细胞，加入3 mL 完全培养基，拍照后放置于培养箱，每3 h 观察并拍照，直到细胞再次覆盖终止试验，以此模拟细胞修复“划痕伤口”，也称伤口愈合试验。

取P3、P9、P15 代的BMSCs，用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，分别以100·孔-1的细胞密度接种于六孔板中，放置于饱和湿度培养箱进行培养；当出现多数形状呈团状的克隆团时，弃培养基，PBS 清洗2~3 次，加入2 mL 4%多聚甲醛30 min，加入3 mL Giemsa 染液染色30 min；然后用蒸馏水缓慢冲洗，加入1~2 mL PBS，通过倒置式显微镜对克隆团的形态和数量进行观察，并用公式（2）计算克隆形成率[12]。

1.6 日本大耳白兔BMSCs 的免疫荧光检测

取密度在90%左右的P5 代细胞，常规消化，分置在6 孔板中，转入培养箱培养，24 h 后用新配的4%多聚甲醛固定细胞25 min；PBS 缓慢冲洗2 次，每孔加入1 mL 0.1% Triton X-100 通透细胞，PBS 缓慢冲洗2 次，加入1 mL PBS 稀释的10%山羊血清封闭30 min，吸出后直接加入PBS 按1∶10稀释的山羊抗鼠一抗CD29、CD44、CD73、CD105，4 ℃孵育过夜，PBS 缓慢冲洗3 次，加入0.99 mL PBS、0.01 mL FITC 标记山羊抗鼠二抗，37 ℃避光1 h，PBS 缓慢冲洗2 次，加入DAPI 染液，37 ℃避光 15 min，PBS 缓慢冲洗1 次，加入1 mL PBS，在激光共聚焦显微镜下观察拍照并记录。以造血干细胞表面分子标记CD45进行免疫荧光鉴定。

1.7 日本大耳白兔BMSCs RT-PCR检测

用Trizol 法提取P5 代细胞总RNA，提取成功后进行反转录，用TaKaRa 反转录试剂盒合成cDNA，反转录体系容量为20 µL。从NCBI 查找间充质干细胞特异性基因（GAPDH、CD29、CD44、CD73、CD105）、造血干细胞分子基因CD45、成骨特异性基因（collage typeⅠ、osteopontin）、成脂特异性基因（PPAR-γ，LPL）成软骨特异性基因（GAPDH、ACAN、SOX9）序列,通过Primer premier 5.0 软件设计引物（表1）,引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。PCR 反应体系50 µL：2×TaqPCR Mix 25 µL,Rnase Free H2O 19 µL, 模板cDNA 2µL，上、下游引物各2 µL。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 min，72 ℃延伸30 s，25 个循环；72 ℃终延伸5 min。反应结束后，用1.7%琼脂多糖凝胶电泳30~35 min后凝胶成像系统下拍照。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.8 日本大耳白兔BMSCs诱导分化能力鉴定

1.8.1成骨诱导 取P3 代大耳白兔BMSCs，当细胞密度至60%~70%时加入成骨诱导液（DMEM/F12 培养基+5% FBS+100 µg·mL-1青、链霉素+0.5µmol·L-1地塞米松+10 mmol·L-1β-甘油磷酸钠+50 µg·mL-1抗坏血酸），每3 d 换液1 次，诱导培养2周左右，参照说明书进行茜素红染色鉴定。

1.8.2成软骨诱导 取P3 代大耳白兔BMSCs，当细胞密度为60% 左右时加入成软骨诱导液（DMEM/F12 培养基+2.5%FBS+ 0.1 µmol·L-1地塞米松+50 µg·mL-1抗坏血酸+0.9 mmol·L-1丙酮酸钠+1%ITS+50 µg·mL-1脯氨酸+100 µg·mL-1青、链霉素+10 ng·mL-1TGF-β3）进行诱导。在2~3 周的时间里，每2~3 d 换液1 次，每天观察细胞是否向软骨细胞形态转变，参照说明书加入阿利新蓝染液进行染色并拍照。

1.8.3成脂诱导 取P3 代大耳白兔BMSCs，当细胞密度至60%时弃原培养基，加入成脂诱导液（DMEM/F12 培养基+10%FBS+1.1 µmol·L-1地塞米松+10 mg·L-1胰岛素+0.5 mol·L-1IBMX+100 µg·mL-1青链霉素+200 µmol·L-1吲哚美辛）。在3 周左右的诱导时间内，每2~3 d 给细胞换液1 次，当发现细胞出现较多脂滴形态后，加入2 mL 4%多聚甲醛 20 min，用PBS 清洗2~3 次，参照说明书使用油红O染色液染色并拍照。

2 结果与分析

2.1 日本大耳白兔BMSCs形态学分析

采用全骨髓贴壁法在培养箱培养1 周后，合适的组织块周围开始不断有呈长梭形、小弓箭型、漩涡形排列的细胞长出（图1）：P1 代细胞除了间充质细胞外，可能还存在其他成纤维性细胞，细胞纯度会随着代次增加而提高，在换代的过程中逐渐弃掉其他细胞；P3 代间充质细胞纯度较高，细胞呈对数期增长，1~2 d 传代1 次；至P28 代时，细胞颜色浑浊，排列混乱，细胞黑斑出现，细胞密度在50%~60%，空泡较多，传代后增殖缓慢，没有活力，甚至不再增殖，细胞开始脱落，传代时间达到4~5 d，这些都是细胞衰老的特征，说明BMSCs 的增殖能力是有限的，随着传代次数增加衰老特征逐渐明显，符合细胞生长正常规律。

图1 日本大耳白兔骨髓间充质干细胞形态Fig. 1 BMSCs morphology of Japanese large ear white rabbits

2.2 日本大耳白兔BMSCs复苏前后活力形态

在细胞培养的过程中，P10 代之前细胞的生长速度和增殖活力强，按1 传2 的比例进行传代，为了实现更有效的细胞资源合理配置，遵循可持续发展原则，在传代的过程中对细胞进行冷冻保存。在试验过程中，将P7 代冻存的细胞进行复苏，对比观察复苏前和复苏后的细胞发现, 复苏前后细胞状态变化不明显，仍具有很强的生命活力（图2）。

图2 日本大耳白兔骨髓间充质干细胞复苏前后形态Fig. 2 Resuscitation morphology of Japanese large ear white rabbits BMSCs before and after recovery

2.3 日本大耳白兔BMSCs 不同代次生长曲线及群体倍增时间

将日本大耳白兔BMSCs 以1×104cell·mL-1接种于24 孔板培养，选取P5、P10、P15 代细胞进行生长曲线测定与绘制(图3)，日本大耳白兔BMSCs低、中、高代次的生长曲线和增值时间大致相似，都呈“S”形，第1~2 天增殖缓慢，为潜伏期；第3~4天增殖加快，代次越低，增殖越快，第4~5 天为细胞对数生长期；第6~7 天趋于平缓，为平台期。P5、P10、P15 代间充质干细胞的群体倍增时间分别是47.37、52.06、56.10 h。

图3 日本大耳白兔骨髓间充质干细胞生长曲线及群体倍增时间Fig. 3 Growth curve， population doubling time of BMSCs in Japanese large ear white rabbits

2.4 日本大耳白兔BMSCs 细胞迁移及克隆形成率

划痕后，每3 h观察拍照1次，6 h内细胞已完全覆盖(图4A)。克隆铺板2周后，对不同代次大耳白兔BMSCs 进行Giemsa 染色，观察克隆染色形成情况，P3、P9、P15克隆形成率分别是（31.50%±1.57%）、(26.70%±2.00%)和（29.15%±1.97%）(图4B)。

图4 日本大耳白兔骨髓间充质干细胞划痕试验及不同代次克隆形成能力Fig. 4 Scratching experiment and clonogenic ability of Japanese large ear white rabbits BMSCs

2.5 日本大耳白兔BMSCs 相关表面标记物鉴定分析

基于间充质干细胞特异性标记基因CD29、CD44、CD73、CD105，检测P4 代日本大耳白兔BMSCs免疫荧光表面标记物，均呈阳性表达。造血细胞表面分子标记CD45呈阴性表达(图5)。对日本大耳白兔BMSCs进行RT-PCR检测结果显示，除了不表达CD45外，CD29、CD44、CD73、CD105均呈阳性表达，符合间充质干细胞生物学特性(图6)。

图5 日本大耳白兔骨髓间充质干细胞免疫荧光Fig. 5 Immunofluorescence of Japanese large ear white rabbits BMSCs

图6 表面标记物RT-PCR检测Fig. 6 RT-PCR result of marker genes

2.6 日本大耳白兔BMSCs成骨诱导分化

第4 代细胞开始采用成骨诱导液培养21 d后，细胞不再是长梭形，开始逐渐形成不规则的骨结节形态；经茜素红染液染色后，骨结节呈现鲜艳深红色（图7）。RT-PCR 结果显示，Ⅰ型胶原蛋白(collage type Ⅰ)和骨桥蛋白(osteopontin, OPN)基因均呈阳性表达。

图7 日本大耳白兔骨髓间充质干细胞成骨分化钙沉积茜素红染色和RT-PCR检测Fig. 7 Detection of calcium deposition in osteoblastic differentiation of Japanese large ear white rabbits BMSCs using alizarin red and RT-PCR

2.7 日本大耳白兔BMSCs成软骨诱导分化

P4 代细胞经软骨诱导液诱导，其形态并未发生明显变化，随着诱导时间延长软骨结节才慢慢凸显，14 d后经阿利新蓝染液染色后，周围形态和排列发生改变，软骨结节呈蓝色。提取RNA 后经RT-PCR 鉴定，该细胞表达ACAN 和SOX9 基因（图8）。

图8 日本大耳白兔骨髓间充质干细胞成软骨分化阿利新蓝染色和RT-PCR检测Fig. 8 Detection of chondrogenic differentiation of Japanese large ear white rabbits BMSCs using Alixin blue and RT-PCR

2.8 日本大耳白兔BMSCs成脂诱导分化

传代至P4 代细胞时，采用成脂诱导液培养14 d 后，细胞质内出现数量不等、大小不一、透亮的脂滴，均呈环样分布；经油红O 染色后，脂滴呈现鲜艳深红色。提取RNA 后，RT-PCR 鉴定结果显示，成脂特性基因LPL 和PPAR-γ 呈阳性表达（图9）。

图9 日本大耳白兔骨髓间充质干细胞成脂分化油红O染色和RT-PCR检测Fig.9 Oil red O staining and RT-PCR detection of adipogenic differentiation of Japanese large ear white rabbits BMSCs

3 讨 论

本研究采用全骨髓贴壁法获取日本大耳白兔BMSCs，考虑到细胞生长所需和材料设备有限等因素，以及在本试验中发现含有12%胎牛血清的培养基可使细胞达到最优生长状态，符合细胞生长规律，因此选出大耳白兔BMSCs 最佳培养体系为217.5 mL 基础培养基+32.5 mL 胎牛血清（FBS）+100 µL 10 ng·mL-1Bfgf+50 µL 20 ng·mL-1EGF+1%谷氨酰胺+1%双抗。其中Bfgf、EGF 是促进细胞生长的因子，具有联合促进细胞生长的作用，谷氨酰胺是必需氨基酸，能够维持细胞正常的生长和代谢，但极不稳定，所以试验过程中需要及时换液[18-21]。在传代消化过程中，要严格把控时间，尽量减少胰蛋白酶对细胞活性的影响，在量的使用和消化时间的把控方面需要严格控制，以延长细胞的寿命[22]。细胞增殖数量呈“S”形，经过潜伏期，细胞能达到最快生长阶段即对数期，随即进入平台期和衰败期。在划痕试验中，人为制造“划痕/伤口”，该细胞在6 h 内再次长满，说明细胞迁移能力和增殖能力较强，随着细胞代次更迭，以及胰酶、离心等操作对细胞造成了一定伤害，在P10代之后细胞迁移能力下降，修复能力减弱，划痕试验可能在免疫、炎症、肿瘤转移、损伤修复及胚胎发育中都会涉及、参与和相互影响[23-24]，因此用干细胞治疗损伤，最好选取代次低的细胞，从而保证修复效果。克隆能力检测试验中，细胞从单个均匀分散的状态，经过快速增殖，变成单个克隆团，说明细胞具有较强的增殖能力。在免疫荧光试验中，需要注意细胞密度不宜过大，以免影响细胞正常形态，在此前提下进行后续操作，可提高试验的成功率和完成度。利用CD29、CD44、CD73、CD105这4 种细胞表面标记物基因，对大耳白兔BMSCs 进行RT-PCR 鉴定，除了阴性对照CD45外，其他都呈阳性表达，鉴定该细胞就是日本大耳白兔BMSCs。CD45是造血干细胞/祖细胞的标志，在造血干细胞中表达，造血干细胞主要存在于造血组织，骨髓中分布最多，其次是脐带[25]，因此该阴性对照对大耳白兔BMSCs 的生物学鉴定有重要作用和意义。在检测细胞多潜能分化能力试验中，在细胞中加入成骨、成软骨、成脂肪诱导液[26]，经2~3 周诱导，通过观察判断细胞诱导程度，本试验中成骨诱导时间快于成软骨诱导快于成脂肪诱导，该细胞成功分化出了成骨、成软骨和成脂细胞，说明细胞具有多向分化的潜能，与Liu等[28]对诱导分化时间的研究结果一致。

本研究通过全骨髓贴壁法成功获取大耳白兔BMSCs，从细胞形态学进行观察，并进行了分子生物学相关鉴定，该细胞在一定的诱导条件下能够分化为骨骼、软骨、脂肪细胞，具有良好的体外增殖能力和多向分化潜能；可为治疗运动损伤提供优质的种子细胞[29-30]，也为利用BMSCs 进行组织与工程学研究和动物遗传资源的保存研究奠定理论基础。