丹霞梧桐组织培养技术研究*

易礼江 荣道军 罗勇志 杨秀兰

（1.广东省沙头角林场，广东梧桐山国家森林公园管理处，广东 深圳 518004；2.广州林芳生态科技有限公司，广东 广州 510520）

丹霞梧桐(Firmiana danxiaensis)为梧桐科(Sterculiaceae) 梧桐属(Firmiana) 落叶小乔木，是广东省特有种，局限生长于韶关市丹霞山自然保护区以及南雄市全安镇苍石寨的丹霞崖壁上，是国家Ⅱ级重点保护野生植物[1]，在《中国物种红色目录》第一卷评估中被列为极危(CR)等级[2]，2012 年被列入《全国极小种群野生植物拯救保护工程规划(2011-2015 年)》。丹霞梧桐树形优美，花序长达30 cm,花序轴、花梗和花均为紫红色，是值得推广栽培的庭园观赏树木[3-4]。目前国内外关于丹霞梧桐的研究报道较少，主要集中在丹霞梧桐群落的地理区系成分分析[5]、空间分布微地貌环境特征[6]以及遗传多样性[7-8]等方面。

丹霞梧桐由于其种子种壳坚硬，在自然生境中繁殖力较低，种群竞争力较弱，造成野生资源贮藏量极其稀少，资源濒临灭绝，且鲜有人工栽培种植。因此，研究丹霞梧桐种子的组培快繁技术进而培育其种苗对保护和利用丹霞梧桐种质资源具有重要意义。本试验通过机械损伤处理丹霞梧桐种子剥掉外壳，再用适宜的培养基进行诱导发芽，以期找到丹霞梧桐快繁的实验方法技术，为丹霞梧桐的保护和解除濒危提供科学依据及技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料分别取自广东韶关南雄的丹霞梧桐种子培育苗的苗木顶芽或嫩茎。

1.2 试验方法

建立体细胞无性系通常有两种途径：一是从外植体上直接分化出不定芽；二是从外植体诱导愈伤组织，再从愈伤组织诱导出不定芽和根，对于多数植物来讲，种子和茎节作为外植体是比较普遍的，也有部分外植体可采用叶片，因丹霞梧桐的叶片无法诱导不定芽，所以本次试验以收集种子和小苗育种出的嫩茎作为外植体进行培养。1.2.1 不同外植体处理方法

外植体接种：取出丹霞梧桐光滑的种子进行人工破壁后，用0.1%氯化汞或15%次氯酸钠进行常规消毒处理8 min，随后无菌水冲洗4~6 次，在无菌条件下自然风干后进行外植体的接种，并观察外植体顶芽及内茎长势。

外植体消毒：将需要的外植体材料阳光下晒2~3 d，再用消毒后的剪刀取顶芽或嫩茎用75%的酒精棉擦拭干净表面的灰尘和多余的皮屑，无菌水冲洗3~4 次后，用0.1%升汞分别消毒4、3、1 min，期间用无菌水各冲洗一次。

1.2.2 不同浓度激素处理丹霞梧桐种子

丹霞梧桐种子预培养：将消毒完毕的种子在超净工作台上自然风干后接入MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.5 mg/L.MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+ 活性炭0.5 g/L+ 椰子汁100 mL/L.MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L 糖30 g/L+琼脂5 g/L。以不加激素的MS培养基为对照，在不同的培养基中进行预培养14 d。

丹霞梧桐种子继代培养：将预培养的小苗转接到MS+6-BA1.0mg/L+GA0.5mg/L.MS+6-BA0.5mg/L+GA0.5 mg/L.MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.3 mg/L 及分别加有0.5 mg/L 的活性炭作对照组，进行愈伤组织和不定芽的诱导。

丹霞梧桐种子继2~3 代培养：继1 代生长旺盛的苗转接到MS+6-BA(0.5、1.0、1.5)mg/L+GA0.5 mg/L.MS+6-BA1.0 mg/L+GA(0.1、0.3、0.4)mg/L.1/2MS+6-BA(0.5、1.0、1.5)mg/L+GA0.5 mg/L.1/2MS+6-BA1.0 mg/L+GA(0.1、0.3、0.4)mg/L.1/4MS+6-BA(0.5、1.0、1.5)mg/L+GA0.5 mg/L.1/4MS+6-BA1.0 mg/L+GA(0.1、0.3、0.4)mg/L.1/8MS+6-BA(0.5、1.0、1.5)mg/L+GA0.5 mg/L.1/8MS+6-BA1.0mg/L+GA(0.1、0.3、0.4)mg/L.MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5 mg/L+活性炭0.5 g/L+椰子汁100 mL/L 的培养基进行继2 代培养，在MS+6-BA1.0 mg/L+GA0.5mg/L+糖（30、45、60）g/L 的培养基上进行继3代培养。

丹霞梧桐生根诱导：以MS+NAA(0.05、0.1、0.15)mg/L+IBA0、5 mg/L+活性炭0.5 g/L 的培养基及MS+NAA 0.05 mg/L+IBA(0.5、1.0、1.5)mg/L+活性炭0.5 g/L 培养基为基本培养基。在基本培养基的基础上，添加糖30 g/L，琼脂粉5 g/L，pH 值调至5.8，培养温度(26±2)℃，光照强度2000~3000 Lx 作为试验组，试验每个处理不少于10 瓶，每瓶2 个外植体，5 次重复。接种后每周对培养物进行观察记录，剔除被污染的培养瓶，接种后3 个月统计出苗数量，待5 次重复试验完成后，总结记录结果。

2 结果与分析

2.1 不同激素对丹霞梧桐种子预培养的影响

经消毒处理后的种子外植体，在不同的激素浓度培养基中按照大头朝下、小头（芽根部）朝上的方式进行接种预培养，在MS+6-BA(0.5、1.0)mg/L+NAA0.5 mg/L+活性炭0.5 g/L+椰子汁100 mL/L 培养基中的外植体生长翠绿而硬挺，茎节粗壮，少部分生长出愈伤组织和不定芽。在其他无活性炭和椰子汁的预培养中出现了玻璃化现象。从表1 可以看出各处理组的发芽率从高到低依次为：MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+活性炭0.5 g/L+椰子汁100 mL/L 处理的发芽率94.87%；MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L 处理的发芽率93.75%；MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭0.5g/L+椰子汁100mL/L处理的发芽率91.67%；MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L 糖30 g/L+琼脂5 g/L 处理的发芽率85%。当添加活性炭和椰子汁后，丹霞梧桐种子发芽比较稳定，发芽率较高，长势相对稳定，其中，MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+ 糖30 g/L+ 琼脂5 g/L+ 活性炭0.5 g/L+椰子汁100 mL/L 培养基中的发芽率高达94.87%，是丹霞梧桐种子发芽培育的适宜培养基，适用于丹霞梧桐的发芽诱导。

表1 不同激素对丹霞梧桐种子预培养的影响

2.2 不同无机盐浓度和不同激素浓度对丹霞梧桐生长的影响

丹霞梧桐虽是典型的落叶型植物，但由于继3 代接种7 d 开始出现了叶片黄化，枯黄并掉落的情况，针对这一情况设计了无机盐浓度和不同激素浓度探究黄化和落叶的原因。由表2 可以看出，不同的无机盐浓度和不同的激素浓度均会出现全部黄化落叶的情况，无机盐的浓度和激素浓度均不造成丹霞梧桐黄化落叶。后期将从其他因素试验寻找可能造成黄化落叶的原因。

表2 不同无机盐和不同激素浓度对丹霞梧桐生长的影响

2.3 不同糖浓度对丹霞梧桐增殖生长的影响

继代增殖的培养基激素相对适宜的是6-BA和GA，根据之前的试验经验得出6-BA0.5、1.0 mg/L+GA0.5 mg/L 作为继代培养效果相对较好，所以在此基础上进行糖浓度设计不同糖浓度对丹霞梧桐增殖生长的影响。

由表3 可以看出，糖含量在45 g/L 的培养中增殖倍数相对于其他糖浓度高出2~3 倍，后面增殖可以使用糖浓度为45 g/L 的培养基中进行继代增殖。

表3 不同糖浓度对丹霞梧桐增殖生长的影响

2.4 生根诱导

由表4 数据可以得到IBA 浓度对于丹霞梧桐生根的诱导相对影响较大，当IBA 浓度达到1.5 mg/L时，生根率达75%，植株生长状况也相对良好。而IAA 的浓度对生根诱导也有一定的作用，但诱导率相对较低。后期的生根诱导中将采用IBA 浓度为1.5 mg/L 进行生根诱导。

表4 不同生根激素浓度对丹霞梧桐生根诱导的影响

2.5 不同pH 值对丹霞梧桐生长的影响

丹霞梧桐是典型的落叶乔木[9]，但在试验过程中出现了继3 代开始一周后全部落叶的情况。由表5 可以看出叶片出现一周落叶的现象同生长基质pH 值有较大的关系。对丹霞梧桐生长的丹霞地貌4 个样方的土壤进行pH 值的测量，分别是4.45、4.12、4.26、4.46，平均值为4.322 5。丹霞梧桐适合生长在酸性土壤，培养基的pH 值也需要相应的降低。

3 结论与讨论

丹霞梧桐种子和茎节使用的培养基大致一样，茎节的培养后期没有种子培养后期长势好，在培养基6-BA0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L 中添加椰子汁100 mL/L 对茎节愈伤组织和不定芽的诱导效果比较明显，在培养基6-BA(0.5、1.0)mg/L+GA0.5 mg/L中添加椰子汁100 mg/L+活性炭0.5 g/L 对种子的愈伤组织和不定芽生长扩繁效果较为显著。

丹霞梧桐是典型的落叶乔木，生长时期落叶属于正常的生理性现象，到达培养的中后期，丹霞梧桐的落叶现象会更加明显。对于无机盐浓度和激素浓度的调节对于改变丹霞梧桐的生理性落叶没有直接作用，后期可以再继续深入尝试其他试验方法对丹霞梧桐的生理性落叶进行调节。种子的预培养中MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+ 活性炭0.5 g/L+椰子汁100 mL/L 是最适宜的培养基。针对丹霞梧桐的预培养长出的真叶进行培养，大部分只能培养出愈伤组织和根，诱导不了不定芽，所以预培养产生的真叶都切除以便后期的生长。

本实验发现用种子和茎节诱导出的愈伤组织容易诱导出不定芽，而叶片诱导的愈伤组织是非胚性愈伤，经过多次试验摸索，得出最适的分化培养基为6-BA(0.5、1.0)mg/L+GA0.5 mg/L 中添加椰子汁100 mg/L+活性炭0.5g/L，诱导的不定芽可进行增殖继代培养。通过对丹霞地貌4 个样方的土壤进行pH 值的测量，平均值为4.32，丹霞梧桐适合生长在酸性土壤，培养基的pH 值也需要相应的降低。下一步计划开展丹霞梧桐种子播种的土壤中通过pH 值调节来降低叶片黄化掉落的比例试验，在生根培养基培养至正常生根，当试管苗长至3~4 cm时，在自然光照下炼苗后移栽。