游泳运动治疗对T2DM焦虑样行为小鼠的影响

张国栋, 郑爽, 秦雨杭, 刘晟洋, 王郁媛, 谢艳丽*

( 1. 山西农业大学体育部, 太谷 030801; 2. 山西农业大学生命科学学院, 太谷 030801)

糖尿病属于“富贵病”的一种,其发生因素不仅与生物学因素相关,而且与情绪、饮食和社会环境因素有关[1]。随着经济的发展及社会环境的改变,糖尿病目前已经成为严重影响人们社会功能和生活质量的疾病,且发病率逐年明显攀升,并且日益成为一个严重的公共卫生问题,被公认为全球性的身心疾病[2-3]。据估计,到2035年,全球二型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的发病率将上升至5.91亿人[3],在过去的几十年里,临床研究表明,抑郁、焦虑等情绪障碍与T2DM之间存在流行病学和神经生物学上的关联。过交感神经影响胰岛素的分泌,从而加快机体内糖代谢紊乱,产生抑郁、焦虑的情绪。T2DM发生神经精神疾病的风险更高,几乎是普通人群的2～3倍,T2DM患者比非糖尿病患者更容易出现抑郁和焦虑[4]。研究表明,T2DM伴随抑郁和焦虑会增加微血管和大血管并发症导致的多器官损伤的死亡率[4]。T2DM情绪障碍的病理生理是高度复杂和多因素的,如功能性胰岛素抵抗、炎症、氧化应激、神经递质系统[5]。焦虑是T2DM最常见的精神共患病和代谢紊乱的一种,涉及持续的恐惧或担忧,自主亢奋,以及行为障碍等极端的回避和自我安慰行为。影响患者的生活质量和医疗费用增加,导致大脑的结构和功能的缺陷[5]。糖尿病引起的脑功能障碍被认为分别与氧化剂或抗氧化剂标志物,如丙二醛[6]、谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物有关[7]。Mosaferi等[8]研究表明,氧化应激是T2DM和焦虑症之间的共同机制,大脑中丙二醛和谷胱甘肽降低可导致啮齿动物焦虑相关行为的增加。毫无疑问,T2DM患者的焦虑相关障碍是需要治疗的健康问题。Matinfar等[9]研究定期运动锻炼可以改善人类和啮齿类动物的代谢和神经精神疾病,如焦虑、情绪紧张和睡眠等。在合理饮食方案基础上应用有氧运动的调养,调节和改进机体大脑和神经系统功能状态,兴奋副交感神经系统,调节神经反射,促进体液循环,改善细胞功能,同时增加皮肤温度,促进周围毛细血管有效扩张,降低血糖等引起血管功能损伤的危险因素。当T2DM适当运动时,愉悦身心,释放压力,从而对患者产生良好的保健功效,调节患者负面情绪,改善生活品质[10]。在不同的神经系统疾病动物模型中,游泳运动被证明可以显著减少焦虑样行为和氧化应激的重要手段之一[11]。

因此,为更好地了解T2DM的焦虑行为,并对小鼠采取有氧运动的干预手段,研究T2DM中焦虑和抑郁的确切机制,拟探讨游泳运动对T2DM小鼠的焦虑样行为和脑氧化应激的发生规律、特点、相关因素进行分析,以期为T2MD与有氧运动的康复提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物

40只7周雄性C57BL/6小鼠,体重在18～21 g,购自北京唯尚立德生物科技有限公司,许可证号为SCXK(京)2021-0054。小鼠饲养环境温度为:(22±3)℃,湿度控制在40%～80%,分笼饲养,自由采食和饮水。试验经北京唯尚立德生物科技有限公司实验动物伦理委员会批准(伦理规范:VS212600885)。设计路线(图1)。

w为周;0～3 w使用高脂饲养和链脲佐菌素构建T2DM小鼠,3 w后血糖检测获得T2DM模型小鼠,随后分组训练小鼠,6 w进行血糖波检测,6～7 w进行旷场和高架十字迷宫检测小鼠焦虑行为,7 w后收集组织进行病理和血生化检测

1.2 T2DM小鼠模型制备

动物分为两组:饲喂正常饲料和高脂饲料3 w。高脂饲料饲养的小鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),连续注射3 d(STZ;65 μg/kg;Sigma)。STZ溶解在柠檬酸缓冲液中(0.1 mol/L,pH 在4.2～4.5)。测量空腹血糖以确认高血糖 (空腹血糖≥11.1 mmol/L即为糖尿病)。每周称重一次,胰岛素抵抗稳态模型评估公式为:HOMA-IR=FBG×FI/405,其中,HOMA-IR为胰岛素抵抗内稳态指数,FBG为空腹血糖,FI为空腹胰岛素。

1.3 游泳试验

试验共分为4组:正常对照组(C),正常+锻炼组(CE),T2DM组(T2),T2DM+锻炼组(T2E)。游泳锻炼可参考相关文献[11]。使用具有控制水温[(32±1) ℃]的玻璃水箱。非糖尿病和糖尿病动物被分为4个亚组:非运动和运动(每组n=10)。在4周的13:00—16:00每周进行5 d的运动。第一周,小鼠适应小水深(5 cm)10 min。从第2～4周,水深和游泳时间逐渐从5 min增加到15 min,从30 min(第3周,3次10 min)逐渐增加到60 min(从第3周开始;每天6次10 min)。每次锻炼之间存在10 min的间隔。未锻炼被放置在空的玻璃水箱中进行相同的时间。

1.4 血糖波动试验

小鼠游泳锻炼之后再记录1 d不同时间节点的血糖。记录6:00、8:00、10:00、12:00、14:00、16:00、18:00、20:00血糖变化。波动差异显示胰岛功能的好坏,动态血糖曲线下面积显示评估胰岛α细胞功能。

1.5 旷场试验

在最后一次游泳练习后的一天,按照前面所述的进行旷场测试。一个正方形的盒子(40 cm×40 cm×20 cm)被分成16个相等的正方形(10 cm×10 cm)。有12个外方和4个内方块。在5 min期间测量内方格的时间和条目,作为焦虑样行为的指标。16个方块的总记录也被记录为运动活动。检测指标包括:水平运动总距离,进入中央总次数、总进入次数和物体识别辨别指数。物体识别辨别指数用 (discrimination ratio,DR)表示。DR=(N-)/(N+F),其中N为小鼠对新奇物体的探索时间,F为小鼠对熟悉物体的探索时间。DR范围为[-,1],“-”提示小鼠完全偏向于熟悉物体,而“1”则完全偏向于新奇物体。

1.6 高架十字迷宫试验

在明暗箱后3 d,动物被暴露于升高的+迷宫中,使用正形器械(离地板高度50 cm),中央区域(5 cm×5 cm),两个张开(30 cm×5 cm×1 cm)和两个闭合臂(30 cm×5 cm×15 cm)。在5 min内记录张开双臂的时间百分比和风险评估,作为焦虑样行为的指标。进入开放臂次数(open arm entry,OE):进入任一开放臂的次数,以四肢均进入臂内为准或者以动物身体 80%进入臂内为准。进入闭臂次数(closed arm entry,CE):进入任一闭臂的次数,以四肢均进入臂内为准或者以动物身体 80%进入臂内为准。开臂活动(open arm time,OT):四肢全部进入或者身体 80%进入开臂内的持续时间。闭臂活动(closed arm time,CT):四肢全部进入或者身体 80%进入闭臂内的持续时间。进入开放臂次数百分比公式如下:OE%=OE/(OE+CE)×100%;开放臂停留时间比例公式如下:OT%=OT/(OT+CT)×100%。

1.7 样本收集

眼眶采血,室温静置1 h,在3 000 r/min离心5 min,收集血清至无菌管中,在-80 ℃下保存待测。小鼠经0.9%的冷氯化钠灌注,取胰腺浸入10%福尔马林缓冲液,常温阴凉处保存。收集全脑,-80 ℃保存。

1.8 苏木精-伊红(haematoxylin eosin,HE)染色

将福尔马林包埋的组织逐渐脱水,包埋在石蜡中,切成5 μm切片,脱蜡,最后使用苏木精-伊红染色。HE染色切片全景扫描,观察胰岛在光学显微镜20倍和40倍下不同组别的病理变化。

1.9 血糖、胰岛素、丙二醛、还原性谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫醚检测

用血糖仪 (ACCU CHEK) 测量空腹血糖,用上海生物工程试剂盒 (Ray Biotech公司) 测定血清中的胰岛素。组织样品在1 mL缓冲液(TBS 0.2% TritonX-100, 2 mmol/L EDTA,PBS与1 mmol/L PMSF)与蛋白酶抑制剂中均质。将匀浆组织离心(15 000 g,4 ℃,15 min)检测上清液。使用(Sigma)公司试剂盒BCA蛋白检测上清液中的总蛋白。采用酶联免疫吸附试验测定脑匀浆上清液中的丙二醛、还原性谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫醚。试验步骤按照南京建成生物工程研究院公司试剂盒(丙烯醛、谷胱甘肽、谷胱甘肽二硫醚)说明书操作。

1.10 统计学分析

使用 SPSS 20.0 软件包对数据进行统计学处理与分析。所有数据以“平均值±标准方差”表示。各指标组间比较采用单因素方差分析,使用最小显著性差异法(least significant difference,LSD)检验进行两两比较,同组实验前后比较采用配对t检验。P<0.05 为差异显著。同时还进行Tukey的真实显著性差异(honestly significant different,HSD)检测。

2 结果分析

2.1 T2DM和游泳运动对体重的影响

从图2可知,与非T2MD组相比,第3周和第6周T2MD的体重显著增加。此外,与未运动的T2MD相比,运动在第6周降低T2MD的体重(P<0.01)。两个非T2DM组之间无显著差异(P>0.05)。

与正常组相比,**P<0.01;与T2DM组相比,#P<0.05

2.2 血糖波动

为进一步探究游泳运动对T2DM的血糖波动影响,检测了6:00、8:00、10:00、12:00、14:00、16:00、18:00、20:00血糖变化。结果(图3)显示血糖在12: 00为一日血糖最高的水平,与T2DM组相比,T2DM+锻炼组血糖在12: 00和16: 00—20: 00血糖显著降低,血糖波动相对较小(P<0.05),而正常组血糖波动无差异(P>0.05)。此外,基于血糖波动变化,分析各组的动态血糖曲线下面积,T2DM+锻炼组血糖血线下面积显著降低(P<0.05),而正常组血糖波动与游泳锻炼无差异(P>0.05),如图3所示。

图3 血糖波动变化

2.3 游泳运动对T2DM焦虑样行为的影响

在经过游泳运动之后,T2DM的运动能力和焦虑行为得到改善,如图4(a)所示。正常组和T2DM组相比,锻炼显著提高水平运动的总距离(P<0.01)。另一方面,与正常组相比,T2DM进入中央总次数显著降低(P<0.01),而运动提高T2DM进入中央总次数(P<0.01),如图4(b)所示。总进入次数在处理组间未有显著变化,如图4(c)所示。分析正常组和T2DM及锻炼后的物体识别辨别指数,发现正常组在锻炼之后提高物体识别辨别指数,特别是在T2DM中这种效果更加显著,如图4(d)所示。

图4 T2DM和游泳锻炼对旷场实验中焦虑样行为的影响

2.4 游泳运动对T2DM高架十字迷宫焦虑样行为的影响

T2DM和运动之间在开放臂上花费的时间显著相互作用(F0W,5W= 4.15,P<0.05)。T2DM和运动分别对开放臂的时间(F0W,5W= 6.28,P<0.05)、次数(F0W,5W= 16.59,P<0.05)和停留在开放臂时间(F0W,5W= 10.41,P<0.05)有主要影响。此外,运动的主要影响被发现用于高架十字迷宫的风险评估。图5(a)和图5(b)显示,与正常组和T2DM组相比,锻炼增加进入开放臂次数(P<0.05),但是对进入闭臂次数无显著变化(P>0.05)。OE%和 OT%:直接反映动物的焦虑水平。焦虑动物的 OE%和 OT%会明显降低,经典抗焦虑药物则使两者升高;图5(c)和图5(d)显示,与正常组和T2DM组相比,锻炼组进入开放臂次数比例(P<0.05和P<0.01)和停留在开放臂时间(P<0.05和P<0.01)显著增加。

图5 T2DM和游泳锻炼对高架十字试验中焦虑样行为的影响

2.5 胰岛面积改变

如图6显示,正常小鼠胰腺细胞结果完整,细胞核清晰,胰岛细胞团为圆形或卵圆形;T2D小鼠胰腺细胞排列松散,胰岛细胞坏死明显。正常小鼠在锻炼游泳锻炼之后,胰岛细胞并未发生改变,而T2DM小鼠胰岛坏死面积较正常组胰岛显著增加,而在锻炼后,胰岛坏死面积均有减小。表明锻炼可以增强胰岛细胞的功能,对胰岛抵抗能力得到一定程度的恢复。

图6 T2DM和游泳锻炼对小鼠胰岛的病理影响

2.6 游泳运动对T2DM葡萄糖、胰岛素和胰岛素抵抗的内稳态的影响

如图7所示,与非T2DM组相比,T2DM组显著增加葡萄糖(P<0.001),胰岛素(P<0.001)和胰岛素抵抗稳态指数(P<0.001)。与非运动T2DM相比,运动的T2DM还显示葡萄糖(P<0.001)和胰岛素抵抗稳态指数(P<0.001)显著降低。两个非T2DM组之间没有差异。

图7 T2DM和游泳锻炼对血糖、胰岛素和胰岛素抵抗稳态指数的影响

2.7 游泳运动对T2DM大脑中氧化和抗氧化标志物的影响

如图8所示,与非T2DM组相比,T2DM升高大脑中MDA(P<0.01)和GSSG(P<0.05),降低GSH(P<0.01)水平和GSH/GSSG比值(P<0.01)。与未运动的T2DM相比,运动显著降低T2DM大脑MDA(P<0.05),增加GSH(P<0.01)。此外,与未运动组相比,正常运动没有显著降低GSSG水平(P>0.05)和GSH/GSSG比值。然而,正常对照组与运动T2DM组的大脑GSH/GSSG比值无显著差异(P>0.05),如图8(d)所示。在两组非T2DM组之间没有观察到差异。

3 讨论

本文研究发现T2DM增加雄性C57BL/6小鼠的焦虑样行为。对小鼠进行两项焦虑测试(旷场和高架迷宫),而且糖尿病和游泳运动的影响在所有这些测试中都是相似的。这些测试证实了啮齿类动物的新奇性诱发焦虑和广泛性焦虑[12]。啮齿类动物,如老鼠和大鼠,通常对噪音和白光表现出一种自然的厌恶开放的环境[13]。因此,它们不在测试中心,而倾向于在黑暗区域或靠近设备壁。T2DM和焦虑症之间的关系已经在人类研究中被报道过。Chaturvedi等[14]研究表明,T2DM患者中普遍焦虑障碍的发生率很高,有很大比例的成人T2DM患者被确定患有焦虑症,这与缺乏体育活动的有关。此外,在动物研究中,有证据表明T2DM与焦虑相关行为增加有关[15]。与本文研究一致,Kale等[16]证明大鼠的T2DM导致高架十字迷宫的焦虑样症状增加。因此,T2DM是焦虑相关疾病发展的危险因素,但其潜在机制尚有待继续研究和证实。

游泳运动可以降低T2DM的葡萄糖和胰岛素抵抗。得到最近的一项Meta分析[17]的支持,其中运动被证明通过减少T2DM的胰岛素抵抗来有效地改善血糖控制。在本文研究中,运动啮齿动物的胰岛素抵抗有显著改善。此外,这些数据还与体重相关。在C57BL/6小鼠中,诱导T2DM导致体重的增加,而游泳运动则降低T2DM的体重。既往研究表明,氧化应激在焦虑相关疾病的发病机制中起着重要作用,T2DM能够增加脑中的氧化应激[10]。为解决T2DM对氧化标志物的影响,并考虑到T2DM会对大脑功能产生不利影响,测量动物脑组织中的MDA, GSH和GSSG。研究显示糖尿病诱导的小鼠在大脑中表现出高水平的MDA和GSSG,而低水平的GSH。发现与非糖尿病动物相比,大脑中的GSH/GSSG比值显著降低与Matinfar[9]的研究结果吻合。一些研究表明,T2DM显著增加大鼠大脑中的MDA,降低GSH水平[18]。总而言之,T2DM有可能通过增加小鼠的大脑氧化应激诱发焦虑样行为。

在这项研究中,观察到游泳运动有效地减轻T2DM大脑中的焦虑样行为和氧化应激。彭焱等[19]报道,与没有焦虑症状的人相比,焦虑症状较高的T2DM的体力活动较低。现在已经通过各种研究确定,人类和啮齿动物运动可以减少焦虑相关行为。然而,有研究表明运动对T2DM患者或动物的焦虑症有益。游泳运动被证明可以减少啮齿动物的焦虑样行为。Bashiri等[20]证明游泳运动可以减轻散发性阿尔茨海默病小鼠的焦虑样行为。研究还表明,压力和压力下的焦虑样行为显著减少[21]。另一点是不同的锻炼方案,包括跑步(跑步机或轮子跑步)和游泳运动用于缓解动物模型中的焦虑症[22],但是游泳运动对于预防/治疗焦虑样行为受到的关注较少。因此,本文研究的结果对于未来T2DM的临床治疗研究具有重要指导和借鉴意义。

本文研究发现游泳运动减少T2DM小鼠脑内的氧化应激标志物(MDA和GSSG)并增加抗氧化因子(GSH)。定期适度的有氧运动似乎可以减轻氧化应激,促进大脑的抗氧化能力[23]。以前的研究[24]表明,游泳运动可以减少大脑中的氧化损伤。这与本文研究结果一致,游泳运动的啮齿动物显示较低的氧化标志物,如大脑中的MDA水平。Atasoy等[25]报道,游泳运动对大鼠海马MDA和GSSG水平的保护作用。在先前的研究中发现,脑氧化应激增加与焦虑样行为之间的关联,氧化剂和抗氧化剂状态正常平衡的紊乱导致脑神经元的损伤[26]。由于行为和生化参数之间存在相关性(数据未显示),导致焦虑样行为的结果似乎可能是由于T2DM和运动的小鼠中脑氧化应激的变化有关,这有待进一步研究。

4 结论

本文研究发现,定期的游泳运动可以改善T2DM小鼠胰岛细胞的代偿功能,减轻胰岛抵抗,改善胰岛素分泌能力,从而调控血糖水平。这提示:游泳运动对糖尿病患者血糖的恢复和稳定可能是一种不错的辅助治疗方式。糖尿病患者往往具有广泛的焦虑性,这主要是糖尿病是一种需要终身治疗的疾病,不能彻底治愈。如果血糖控制不佳,往往会引起各种并发症,严重甚至会导致糖尿病患者的死亡。本研究显示游泳运动有效地减轻T2DM小鼠的运动能力和焦虑行为,如水平运动的总距离、物体识别辨别指数、开放臂次数和闭臂次数等,这提示合理的运动能够改善糖尿病患者焦虑,同样为游泳运动缓解其他相关疾病带来的焦虑治疗提供一个新的思路。

长期高血糖以及高游离脂肪酸可以通过多种代谢途径产生大量的自由基,诱导“氧化应激反应”。本文研究显示,进行游泳运动后,糖尿病小鼠血清中氧化应激标志物MDA和GSSG显著降低,抗氧化应激标志物GSH显著增加,表明游泳运动能有效降低机体内的氧化应激水平,抗氧化应激是治疗糖尿病并发症的新策略。