中药联合二甲双胍治疗糖尿病配伍规律研究

杜争, 吴宿慧, 李寒冰, 李根林*, 徐江雁

(1.河南中医药大学药学院, 郑州 450046; 2.河南中医药大学, 郑州 450046; 3.河南省健康衰老产业工程研究中心, 郑州 450046)

近现代以来,中西药结合发展取得了长足发展。《医学衷中参西录》[1]作者张锡纯认为:“欲求医学登峰造极,诚非沟通中西医不可”。全国名中医刘宝厚教授经过多年临床探索,提出“中西医双重诊断,中西药有机结合”的临床医学模式,认为中医病名多以症状命名,而辩证论治才是中医的精髓。中医的辩证与西医的诊断应有机结合起来,这样才能全面地了解患者情况,准确判断中西药各自的治疗优势,取长补短,进行中西医结合治疗[2]。诺贝尔医学奖获得者屠呦呦在诺贝尔医学奖颁奖典礼也说到:“中西医药各有所长,两者有机结合,优势互补,当具有更大的开发潜力和良好的发展前景[3]。中西医结合发展,更是受到国家层面的重视,“中西医并重”已经成为中国医药卫生事业发展的基本方针,国家领导人更是在多个场合强调“中西医结合”的重要意义。有研究表明,中西医结合在治疗疾病过程中,相对于单一中医或西医疗法具有独特优势,取得了较好疗效,特别是新冠疫情防治中表现突出,从第五版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行版)》开始,“中西医并重”就成为中国防治新型冠肺炎的基本政策[4]。因此针对中西医结合的理论和临床研究也逐渐成为医药工作者的研究热点。目前中外学者针对中西医结合的研究,主要集中在临床疗效的报道上,而针对中西药联合使用的用药规律及相互作用机制研究却鲜见报道。

数据挖掘是指从大量的数据中通过算法搜索隐藏于其中信息的过程,目前已经在中医药领域得到了广泛应用。中外诸多学者采用了数据挖掘的技术,如采用关联规则算法分析中药方剂中的药物配伍规律;采用聚类分析对具有模糊性的中医药数据进行处理,分析中药配伍的潜在关系[5-6]。利用数据挖掘技术对中医药的本质及规律的研究,在一定程度上解决了中医药配伍规律复杂、难以有效阐明配伍特点的难题[7-8]。网络药理学是一门融合了药理学、生物信息学等多学科的系统生物学的理论技术,在研究药物的整体性,系统性及药物成分与疾病相互作用方面具有优势,可从整体上阐明药物的作用机制,与中医的整体观念具有一致性[9]。数据挖掘与网络药理学技术联用在中医药研究中也得到了广泛应用,为中医药研究提供了新的思路。而同时采用数据挖掘及网络药理学方法探究中西药联合用药规律及作用机制的研究的报道也鲜见报道。

糖尿病发病机制包括遗传、血液流变遗传、肥胖等多种复杂因素[10-11],中国更是糖尿病患者最多的国家,二甲双胍或盐酸二甲双胍是中外治疗糖尿病的首选药物,无论是单独使用或联合其他药物,均在降低糖尿病患者高血糖症状方面具有良好疗效。研究发现,二甲双胍可通过激活腺苷酸蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK),抑制糖异生基因转录;抑制胃肠道对血糖的吸收;同时,二甲双胍还可通过促进外周组织对葡萄糖的摄取,发挥降血糖作用[12]。然而二甲双胍在治疗糖尿病过程中,也存在诸多不良反应,临床常见的有伴随腹泻、呕吐的胃肠道系统损伤、肝损伤、中枢神经系统等[13-14],这也限制了二甲双胍的临床使用。现代研究表明,中西药联合治疗糖尿病,均取得了较好的效果,同时也减轻或消除了二甲双胍的不良反应[15]。因此,现以糖尿病为出发点,采用数据挖掘与网络药理学联机分析临床上中药联合二甲双胍治疗糖尿病的用药规律、相互作用的机制,为中西医联合用药、中西医结合的发展做出贡献。

1 资料与方法

1.1 数据来源

采用高级检索方式,以“二甲双胍AND糖尿病OR消渴”为关键词,在中国知网(CNKI)、万方数据库、维普数据库、Pubmed检索相关文献,检索自建库至2021年8月20日的文献。

1.2 纳入标准

①文献为临床实验研究;②文献需为中药复方联合二甲双胍治疗糖尿病;③文献中处方完整,中药组成及剂量明确;④用药方式为口服。

1.3 排除标准

①动物实验类文献;②处方不完整,用药剂量不明确,中药组方含随证加减的文献;③重复发表的文献;④使用二甲双胍外,同时使用其他西药的文献。

1.4 数据处理

将收集到的中药名称、功效以及性味归经,参考2020版《中国药典》及《中药大辞典》进行标准化处理。如田七、田三七同一规范为三七,生甘草、甘草、炙甘草统一规范为甘草,生山楂、山楂、焦山楂统一规范为山楂,怀山药、淮山药、生山药统一规范为山药,云苓、茯苓、赤茯苓统一规范为茯苓,生大黄、酒大黄、制大黄、大黄统一规范为大黄,山栀、栀子统一规范为栀子,山茱萸规范为山萸肉,川厚朴规范为厚朴,粉丹皮、丹皮、牡丹皮统一规范为牡丹皮,卫矛规范为鬼箭羽,元参规范为玄参,生石膏规范为石膏,地黄、生地统一规范为生地黄,醋元胡统一为延胡索,清半夏、姜半夏、法半夏统一为半夏,旱莲草统一为墨旱莲。

1.5 中药联合二甲双胍治疗糖尿病的临床用药规律分析

将规范好的中药复方输入Excel中,使用IBM SPSS Statistics、进行药物使用频次、用量、性味归经、聚类、关联规则、复杂网络等分析及可视化处理。

1.6 网络药理学机制研究

结合1.5节的频率统计、关联规则及聚类分析结果得到核心药物,在中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP:https://tcmsp-e.com/)收集核心药物化学成分,基于口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30和类药性(drug likeness,DL)≥0.18进行筛选,剔除无潜在靶点成分,同时结合文献报道对筛选后的成分进行补充,最终确定其活性成分,通过Pub chem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)检索活性成分的Canonical SMILES,并将Canonical SMILES输入Swiss TargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/),物种选择智人,查询活性成分对应靶标蛋白的基因名称,最终确定核心药物的活性成分及对应靶点,同时在GeneCards(https://www.genecards.org)数据库中输入关键词“糖尿病”,收集疾病的相关靶标,在CTD(http://ctdbase.org/search/)数据库、Swiss TargetPrediction中检索糖尿病一线治疗药物二甲双胍的对应靶标信息,将所获得的靶标取并集,去除重复项,得到糖尿病的相关靶标信息;将核心中药、二甲双胍对应的靶点与糖尿病的靶点进行匹配,得到核心药物治疗糖尿病的关键靶点。构建中药-成分-靶点关系可视化网络;将交集靶点导入STRING平台,将物种设置为“homosapiens”,隐藏单独靶点,置信度设置为 0.9,构建 PPI网络,将得到的TSV格式文件导入Cytoscape3.7.2进行拓扑分析,采用 HIPLOT分析平台,KEGG.DB选择 public/db/keg/has-kegg-20210326.rds,org.DB选择org.Hs.eg.db,设置 PCuttoff:0.01,Qcuttoff:0.05,对核心靶点进行GO功能富集分析和 KEGG信号通路分析。

1.7 分子对接验证

通过TCMSP数据库得到核心中药-成分-交集靶点中度(Degree)值排名靠前的成分的mol2结构,通过PDB数据库下载蛋白互作网络中度(Degree)值排名靠前的靶点蛋白的3D结构,使用Open Babel-2.4.1软件、AutoDockTools-1.5.7软件分别对小分子和靶蛋白进行加氢、去电荷等前处理,在AutoDock.1.5.7软件将处理后的成分与靶点进行分子对接,最后通过PyMOL软件将对接结果进行可视化。

2 结果分析

2.1 文献纳入情况

在中国知网(CNKI)、万方数据库、维普数据库、Pubmed进行高级检索,中文检索词为“二甲双胍AND糖尿病OR消渴”,英文检索词为metformin、diabetics进行主题检索,利用知网研学软件进行合并去重,得到文献189篇,根据本研究的纳入及排除标准筛选后,得到151个处方。

2.2 药物使用频次分析

出现频次较高的中药分别是黄芪、茯苓、山药、甘草、黄连、葛根。使用频次≥20的药物共有23味,如表1所示。

表1 联合二甲双胍治疗糖尿病处方中使用频次20以上的中药

2.3 性味归经分析

根据2020版《中国药典》及《中药大辞典》的分类标准,对纳入的中药的性味归经进行统计分析,结果显示药性以平(36.89%)、寒(31.07%)为主;药味以甘(32.37%)、苦(24.10%)、辛(21.58%)为主;归经以肝经(20.09%)、肺经(16.17%)、脾经(14.55%)为主。

2.4 用量分析

对使用频次排名前5的中药(黄芪、茯苓、山药、甘草、黄连)进行用量分析,结果如图1所示。由图1可知,黄芪的最大为500 g,最小剂量为6 g,临床常用剂量为30 g;茯苓临床最大使用剂量为100 g,最小剂量为10 g,使用频次最高的为15 g;山药最大使用剂量为150 g,最小剂量为10 g,临床常用剂量为15 g;甘草使用频次最高的为6 g;黄连使用频次最高的10 g。

图1 高频中药用量与频次

2.5 关联规则分析

将数据整理成N和Y的格式,即用了这味药标记为Y,没有用这味药的标记为N,通过源节点导入IBM SPSS Modeler 18软件,将数据类型选择为标记,角色为任意,与图型选项板下的网络相连接,选择所有药物,按照连接强弱分为高、中、低进行绘图,制作出网络图,如图2所示,由图2可见,黄芪、茯苓、山药、甘草、丹参具有较强的关联性,其中连线的粗细代表了连接强度的大小,表明在临床和二甲双胍联合治疗糖尿病的中药处方,以上药物经常共同出现。

图2 联合二甲双胍治疗糖尿病(Diabetes)的中药关联规则

在模型选项版下选择Apriori节点,与类型节点连接,设置最小置信度80%,最低支持度10%,最大前项为5,对药物进行关联规则分析,根据Apriori算法,共产生41条规则,关联规则如表2～表4所示。

表2 药对组合

表3 3种中药组合关联规则

表4 4种中药组合关联规则

2.6 聚类分析

对使用频次≥20的药物进行聚类分析。将数据导入IBM SPSS Statistics 26.0中,选择分析菜单下,分类项下的系统聚类,由于不清楚分类结果,设置聚类范围在5～10,进行尝试性分析,连接方式为组间连接,方法为皮尔逊相关系数,生成聚类分析树状图,如图3所示。由图3可知,聚类为5时,结果为类1(黄芪、丹参、生地黄、天花粉、麦冬、川芎、五味子);类2(茯苓、山药、白术、泽泻、山茱萸、党参、牡丹皮、熟地黄);类3(甘草、葛根、);类4(黄连、玄参、黄芩、苍术、);类5(白芍)。

图3 常用中药聚类分析

2.7 复杂网络可视化分析

将IBM SPSS Modeler 18软件生成的关联规则数据导入到Cytoscape3.7.2软件中制作可视化网络,如图4所示。颜色越深,越靠近中心位置,代表连接度越高,由图4可知,黄芪,茯苓、山药、甘草、白术、葛根,连接度较大,为临床中联合二甲双胍治疗糖尿病的核心中药组成药物。

2.8 网络药理学机制研究

根据频数、关联规则、聚类分析、复杂网络综合分析,结合中医用药特点,甘草为调和药性的常用药味,故认为中药黄芪、茯苓、丹参、山药、葛根、白术为联合二甲双胍治疗糖尿病的临床常用的核心中药组成,对核心中药成分、靶点进行筛选,共得到成分96种,如表5所示,靶点1 116个;检索得到糖尿病相关靶点16 793个,检索得到二甲双胍靶点906个,利用韦恩图获得核心中药靶点、二甲双胍及糖尿病三者交集靶点204个,如图5所示,为核心中药与二甲双胍联合治疗糖尿病的共同作用靶点。

图5 核心中药、二甲双胍及糖尿病靶点交集图

表5 核心中药成分信息

将中药的活性成分及交集靶点导入Cytoscape3.7.2,构建“中药-成分-交集靶点”可视化网络,如图6所示,其中来源于黄芪的华良姜素、异鼠李素、Garcinone-B、木犀草素、槲皮素为度(degree)值排名靠前的成分,在中药联合二甲双胍治疗糖尿病中发挥着重要作用。将交集靶点导入STING数据库,隐藏单独靶点,设置得分为0.9,得到的结果导入Cytoscape3.7.2,靶点的自由度越大,表明靶点在治疗糖尿病的过程中发挥作用的可能性越大,核心靶点互作网络,如图7所示,其中,颜色越深,形状越大,代表在中药联合二甲双胍治疗糖尿病过程中发挥作用的可能性越大,结果表明,肿瘤抗原p53 (tumor antigen p53,TP53)、丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)、蛋白激酶Bα(protein kinase Bα,AKT1)、丝裂原激酶的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、等基因在核心中药联合二甲双胍治疗糖尿病治疗具有重要作用。利用HIPLOT在线分析平台对交集靶点进行基因本体(GO)功能与信号通路(KEGG)富集分析。结果表明,生物过程中,主要涉及对无机物的应答、对氧化应激应答、细胞对化学刺激的应答等靶点、在细胞组成中,主要涉及神经元胞体、细胞膜、细胞转运等方面;在分子功能上,主要涉及蛋白激酶活性及DNA合成等方面,如图8所示;KEGG信号通路分析结果显示,交集靶点显著富集在癌症相关通路、乙型肝炎、细胞凋亡、胰岛素抵抗、内分泌等相关通路上,如图9所示。

图6 中药-成分-交集靶点网络分析

图7 交集靶点蛋白互作网络

图8 GO基因功能富集分析

图9 KEGG信号通路分析

2.9 分子对接验证

通过分子对接技术,对网络药理学预测结果进一步分析,选取“中药-成分-交集靶点”度(Degree)值靠前的华良姜素、Garcinone-B、葛根素、异鼠李素、木犀草素5个成分与“交集靶点蛋白互作”中度(Degree)值靠前的TP53、MAPK3、MAPK1、AKT1、RELA个核心靶点进行对接,对接结果一般用结合能来评估成分与靶点的结合能力、结合能≤0表明可以自由结合、结合能越低,表明小分子与靶点蛋白之间的亲和力越大,二者相互作用的可能性越高。各成分与靶点对接结合能结果(表6)。 选取结合能最低的“成分-靶点“进行可视化处理(图10),其中蓝色为蛋白质受体,红色为小分子配体,黄色虚线为氢键,表示配体与受体结合较稳定。

图10 Garcinone-B-MAPK1分子对接图

表6 核心成分与核心靶点对接结合能表

3 讨论

3.1 基于药性、归经及功效的中药联合二甲双胍用药规律分析

联合用药规律上看,使用最多的药性为平、寒,可见,中医在联合二甲双胍治疗糖尿病时,可能具有明显寒凉偏向,这点也与中医认为“糖尿病”即“消渴”以阴虚津亏,内热偏胜为主的观点一致[16]。药物的归经则主要归肝经,肝脏的功能失调与糖尿病的发生发展具有密切关系,肝脏功能失调则气血津液及精微物质输布代谢失常,是引起糖尿病的重要因素之一,此外,中医学认为,肝与情绪相关,而情绪因素也是导致糖尿病的重要原因之一[17]。现代医学研究发现,肝脏是机体代谢的重要场所,肝脏合成的肝酶,糖原等物质与人体糖代谢,调节人体血糖水平。《灵枢·本藏》篇记载:“脾脆,善病消瘅”,《金匮要略·消渴小便不利淋病脉证并治》记载:“虚则卫气不足,劳则荣气竭…即为消渴”,可见,消渴的病机可能是“气虚”。药物关联规分析中筛选的常见组合药物为黄芪、山药、白术、茯苓等与二甲双胍联用,其中黄芪、白术、山药是补虚药中最常用的药物之一,此用药特点亦符合中医对消渴病机辩证特点。

3.2 基于增效、减毒的中药联合二甲双胍用药规律及作用机制分析

中药配伍理论是中医药特色之一,通过药物之间的配伍使用,可发挥增效减毒的临床作用,使用药更加安全、有效。中药配伍理论,始载于《神农本草经》,记载:“药有阴阳配合,有单行者,有相须者,有相畏者,有相恶者,有相反者,有相杀者,凡此七情,和合视之。”中药联合二甲双胍治疗糖尿病亦具有增效。本文研究表明,在中药联合二甲双胍治疗糖尿病的临床应用中,核心组方中药分别为黄芪、茯苓、山药、葛根、白术、丹参。网络药理学研究发现,核心中药共有活性成分96种,GO富集分析结果表明,核心中药可与二甲双胍,共同作用于机体对无机物应答、氧化应激应答、细胞对化学刺激应答等生物过程;在细胞组成方面,可共同作用于神经元胞体、细胞膜、细胞转运等;在分子功能上,主要涉及蛋白激酶活性及DNA合成等方面;同时KEGG信号通路分析结果显示,核心中药联合二甲双胍可共同作用于细胞凋亡、胰岛素抵抗、内分泌等相关通路上。此外,分析结果显示,槲皮素为核心中药中共有成分,槲皮素在研究中,被发现具有促进胰岛素分泌作用,在生理浓度范围内,可激活CaMKKβ/AMPK通路和胰岛素信号通路,增加细胞对葡萄糖的摄取,而发挥降血糖作用[18];同时,来源于核心中药组方的华良姜素、Garcinone-B、葛根素、异鼠李素、木犀草素与二甲双胍均可共同作用于MAPK1、MAPK3、AKT1、TP53、RELA核心靶点,现代药理研究表明,核心中药均具有降血糖、抗氧化等作用,黄芪主要活性成分黄芪甲苷具有清除自由基作用,可减少由高糖引起的胰脏氧化损伤[19];茯苓提取物具有降低空腹血糖、调节脂质代谢及抗氧化及改善胰岛素抵抗[20];葛根中的葛根素可通过PI3K/Akt/GSK-3β信号通路增加肝细胞内糖原含量,调节胰岛素抵抗[21],来源于丹参药材的有效成分丹酚酸B具有减轻氧化应激和细胞凋亡作用,降低胰岛素敏感性胰岛素受体底物1(IRS-1)的磷酸化和改善胰岛素抵抗作用[22]。这些活性成分及途径均可能是中药联合二甲双胍治疗糖尿病发挥治疗协同增效作用的机制之一。

相对于中药配伍增效作用,减毒亦是中药联合二甲双胍治疗糖尿病的重要机制之一。研究发现二甲双胍在临床使用中的不良反应有胃肠道系统、中枢神经系统、肝功能损伤等[13],其中最主要的是胃肠道不良反应,这也是限制二甲双胍临床使用的最主要因素[14]。在临床常与二甲双胍联合使用的中药中,白术具有强烈的胃肠道作用,可调控胃肠道运动,促进排空,可对二甲双胍发生的胃胀气等消化道系统不良作用有缓解作用[23],黄芪中有效成分黄芪甲苷具有保护胰脏作用[19],同时促进自噬过程,而起到改善糖尿病所致的肝脏损伤[24]。糖尿病主要危害在于多种并发症,其中醛糖还原酶是多元醇代谢的关键限速酶,机体在高糖环境下会多元醇代谢被激活,产生的代谢物质山梨醇会在体内积聚,对机体造成损伤[25]。而槲皮素及其衍生物是天然的醛糖还原酶抑制剂,可降低醛糖还原酶活性[26]。这些研究表明,中药联合二甲双胍在治疗糖尿病上,可起到降低二甲双胍毒副作用的特点,符合中药配伍减毒的理论。

3.3 分子对接分析

由分子对接结果可以看出,联合二甲双胍治疗糖尿病的核心中药成分华良姜素、Garcinone-B、葛根素、异鼠李素、木犀草素与核心靶点均能形成稳定结构,且均具有氢键,表明核心成分可能为核心中药联合二甲双胍共同作用的主要有效成分,且主要作用于AKT1、MAPK1、MAPK3、RELA、TP53等核心靶点。

4 结论

综上所述,中药联合二甲双胍治疗糖尿病的主要用药为平、寒药物,以对症治疗糖尿病即“消渴”病“阴虚内热”为主要思路,得到的核心中药为:黄芪、茯苓、山药、葛根、丹参、白术,根据网络药理学及分子对接及结果表明,核心组方与二甲双胍联合用药可共同作用与AKT1、MAPK、RELA、TP53等核心靶点,共同发挥治疗糖尿病作用,此外中药复方可降低或缓解二甲双胍的不良反应,中药联合二甲双胍在治疗糖尿病中可发挥协同作用,起到增效减毒作用,可为中西医联合治疗糖尿病的进一步研究和临床用药提供科学指导。