阿替普酶联合红花提取物调节TLR4-NLRP3信号通路对大鼠急性脑梗塞的影响

刘明亮, 杨森林, 马 超

(河北省沧州中西医结合医院急诊科, 河北 沧州 061001)

急性脑梗塞(Acute cerebral infarction,ACI)是脑部因血液供应不足导致局部缺血缺氧引起脑组织出现坏死和软化的症状,多发病于老年人,数据显示,ACI患者年龄有年轻化趋势,严重威胁人们的身体健康[1]。阿替普酶是一种血栓溶解药物,能够直接激活纤维酶原转化为纤溶酶来降解纤维蛋白,在治疗心肌梗死上具有显著效果[2]。于海燕等[3]发现阿替普酶可促进脑梗死大鼠神经功能恢复。然而,溶栓治疗的时间窗口很窄,并与脑出血等致命性并发症有关[4]。红花提取物来自菊科植物红花(Carthamus tinctorius L.),现代药理实验表明红花提取物可影响血小板的聚集,能够延长凝血时间,抑制血栓形成,对于大鼠急性心肌缺血有很好的保护作用[5]。但关于红花提取物联合阿替普酶是否能够起到联合疗效,并获得更有益作用的研究尚未见报道。TLR4-NLRP3通路被认为参与调节炎症反应、细胞凋亡等的重要信号通路[6]。杨波等[6]发现原花青素可通过抑制TLR4-NLRP3通路对脑缺血再灌注损伤起保护作用。本研究对阿替普酶联合红花提取物可通过调节TLR4-NLRP3通路改善ACI损伤进行了探索,以期为ACI的治疗提供数据参考。

1 材料与方法

1.1实验动物:SPF级SD大鼠30只(雌雄各半),体质量220～250g,由河北医科大学(实验动物公共服务平台)提供,使用许可证号:SYXK(冀)2020-002,生产许可证号:SCXK(冀)2020-001,大鼠饲养于恒温(22～25)℃、恒湿的SPF层流罩中。

1.2药物与试剂:阿替普酶(CAS:105857-23-6,纯度≥98%)购自LGM Pharma(北京);红花提取物(批号:20130326)购自远方药业有限公司;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,批号:C428BA0042)购自上海生物工程股份有限公司;EB染料(批号:71016588)购自上海国药化学试剂有限公司;Trizol试剂(批号:15596018)购自美国Invitgen;PrimeScriptTM RT试剂盒(批号:RR047A)购自日本Takara;相关一抗MMP-2(货号:ab92536)、MMP-9(货号:ab283575)、Bax(货号:ab32503)、Bcl-2(货号:ab182858)、TLR4(货号:ab13556)、NF-κB p65(货号:ab288751)、p-NF-κB p65(货号:ab239882)、NLRP3(货号:ab263899)、caspase1(货号:ab207802)、pro-IL-1β(货号:ab216995)及二抗(货号:ab6721)购自英国Abcam;BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号:P0009)购自Beyotime;ECL发光试剂盒(货号:KF001)购自Affinity。

1.3主要仪器:SpectraMAX Plus384酶标仪购自美谷分子仪器有限公司生产;BA210Digital数码三目摄像显微镜购自麦克奥迪实业集团有限公司;JY200C电泳仪购自北京君意东方电泳设备有限公司。

1.4急性脑梗塞大鼠模型制备:大鼠适应性饲养1周后,进行ACI模型建立[7]:首先用1.5%戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉大鼠,仰卧固定于实验台,充分暴露其颈部皮肤,75%酒精消毒,通过颈正中切口分离大鼠左侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)。将直径0.26mm的圆形尖端单丝尼龙缝线引入ECA管腔,然后轻轻推进到ICA,以阻断大脑中动脉(MCA)的起始点。假手术组大鼠将尼龙线插入ECA管腔,但不向颈内动脉推进。阻断2h后,拔除尼龙线,缝合伤口,75%乙醇消毒。模型制备完成以后,给予大鼠抗感染护理,大鼠苏醒后,进行神经功能评定,得分大于3,则视为ACI造模成功。

1.5分组及给药方法:将建模成功的大鼠随机分模型组、阿替普酶组(尾静脉注射阿替普酶5mg/kg)、红花提取物组(尾静脉注射4g/kg)、阿替普酶联合红花提取物组,每组6只,假手术组6只。阿替普酶组大鼠按5mg/kg剂量尾静脉注射阿替普酶;红花提取物组大鼠尾静脉注射红花提取物4g/kg;阿替普酶联合红花提取物组尾静脉注射阿替普酶(5mg/kg)+红花提取物(4g/kg);假手术组和模型组大鼠注射等体积的无菌0.9%氯化钠溶液,连续治疗7d。

1.6观察指标

1.6.1神经功能缺损评分:根据Zea Longa等的五级分级系统评价神经功能:0分为无缺陷;1分为不能伸展对侧前爪;2分为纵向旋转;3分为跌向对侧;4分为不能自发行走。

1.6.2TTC染色评价梗死面积:最后一次给药4h后,处死大鼠,取出脑组织,在-20℃下冷冻15min,切成1mm厚的冠状切片,用2%的TTC在37℃孵育15min,梗死区组织呈白色,正常组织呈红色。采用ImageJ软件测量切片面积。

1.6.3HE染色观察组织病理变化:取脑组织制作石蜡切片,苏木精-伊红(HE)染色,观察脑组织的病理形态。光镜下观察脑组织病理变化。

1.6.4伊文思蓝(Evans blue)含量测定:分别取各组2只大鼠,在最后一次给药后3h经股静脉注射3%EB染料(20μL/10g体重)。大鼠注射EB后1h,灌流生理盐水100mL 1h后,取脑组织,两个大脑半球沿矢状缝分开,取缺血侧大脑半球称重,在60℃的3mL甲酰胺中孵育24h,3000r/min离心20min,上清液在632nm波长处用测定吸光度。用标准曲线计算脑组织中EB的含量为ng/g。

1.6.5TUNEL法检测各组细胞凋亡:将脑组织切片切成4～6m厚,脑切片在37℃下与末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)孵育1h,用PBS洗涤3次,然后在室温下与IgG孵育30min。以0.02% H2O2为酶底物,以四氯化二氨基联胺(DAB)为显色剂,显色。计数来自每个切片的5个不同区域的细胞。

1.6.6qRT-PCR检测TLR4、NF-κB p65、NLRP3表达:使用Trizol试剂提取脑组织总RNA,然后使用PrimeScriptTM RT试剂盒将RNA反向转录为cDNA,作为聚合酶链式反应扩增的模板。使用SYBR PreMix Ex TaqTM Ⅱ定量基因表达水平,使用的基因特异性引物如下:TLR4:正向:5'-ATC GGTGGTCAGTGTGCTTGTGGTAG-3',反向:5'-TTCCTGGATGATGTTGGCAGCAATGG-3';NF-κB p65:正向:5'-GCCAGCACCAAGACCGAAGCAATT-3',反向:5'-TACCGCCAGCAGCATCTTCAC ATCTC-3';NLRP3:正向:5'-ACCACCACCTCCAAGACCACCACGG-3',反向:5'-GCCATCAGCAGCCAA GGAGCAGAGA-3';GAPDH:正向:5'-TGAAGAACAGGGAAGCAGCAA-3',反向:5'- ATCCAGTCCATT TTCCACCACA-3'。以GAPDH作为内参。qRT-PCR反应条件:95℃初始变性10min,随后95℃变性10s,60℃退火10s,72℃延伸10s,45个循环,记录CT值,采用2-△△CT分析相对表达水平。

1.6.7Western blotting分析脑组织MMP-2、MMP-9、Bax、Bcl-2、TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3、caspase1、pro-IL-1β蛋白表达:收集的脑组织在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解。冰上孵育离心后,收集上清液,用BCA法检测蛋白质浓度,并通过SDS-PAGE电泳法进行蛋白质分离。然后将蛋白质转移到PVDF膜上,用5%脱脂牛奶中室温封闭2h后,以β-actin为内参,分别与MMP-2(1∶500)、MMP-9(1∶500)、Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、TLR4(1∶500)、NF-κB p65(1∶500)、p-NF-κB p65(1∶500)、NLRP3(1∶500)、caspase1(1∶500)、pro-IL-1β(1∶500)和β-actin (1∶1000)抗体在4℃孵育过夜。用TBST冲洗膜3次,用与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二级抗体(1∶500)37℃孵育1h,用ECL试剂显带。采用ImageJ软件计算灰度值。

2 结 果

2.1阿替普酶联合红花提取物对急性脑梗大鼠脑组织损伤的影响:与假手术组相比,模型组Zea Longa评分显著升高,梗死面积显著增加(P<0.01),脑组织大量锥体细胞坏死。与模型组相比,红花提取物组、阿替普酶联合红花提取物组Zea Longa评分显著降低,梗死面积显著减小(P<0.05),脑组织局部区域大量锥体细胞坏死,细胞形态较为清晰,且阿替普酶联合红花提取物组改善效果更为明显。与阿替普酶组相比,阿替普酶联合红花提取物组梗死面积显著下调(P<0.05),脑组织轻微受损。见图1。

图1 各组大鼠脑组织损伤比较

2.2阿替普酶联合红花提取物对急性脑梗大鼠血脑屏障破坏的影响:与假手术组相比,模型组EB含量及MMP-2、MMP-9蛋白表达显著上调(P<0.01);与模型组相比,阿替普酶组、红花提取物组、阿替普酶联合红花提取物组EB含量及MMP-2、MMP-9蛋白表达显著下调(P<0.05);与阿替普酶组相比,阿替普酶联合红花提取物组EB含量及MMP-2、MMP-9蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图2。

图2 各组大鼠血脑屏障破坏比较

2.3阿替普酶联合红花提取物对急性脑梗大鼠组织细胞凋亡的影响:与假手术组相比,模型组细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著增加,Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,阿替普酶组、红花提取物组、阿替普酶联合红花提取物组细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著降低,Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05);与阿替普酶组比较,阿替普酶联合红花提取物组Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图3。

图3 各组大鼠细胞凋亡比较

2.4阿替普酶联合红花提取物对急性脑梗大鼠TLR4/NLRP3通路的影响:与假手术组相比,模型组TLR4、NF-κB p65、NLRP3 mRNA表达及TLR4、NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65、caspase1、pro-IL-1β蛋白表达显著上调(P<0.05);与模型组相比,阿替普酶联合红花提取物组TLR4、NF-κB p65、NLRP3 mRNA表达及TLR4、NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65、caspase1、pro-IL-1β蛋白表达显著下调(P<0.05);与阿替普酶组相比,阿替普酶联合红花提取物组NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65蛋白表达显著下降(P<0.05)。见图4。

图4 各组大鼠TLR4/NLRP3通路因子表达水平比较

3 讨 论

近年来,ACI发病率呈上升态势,2016年我国缺血性脑卒中患病率达到1762.77/10万,改善ACI损伤已显得十分重要[1]。本研究探讨了阿替普酶联合红花提取物对ACI的影响。研究报道,神经功能缺失评分、脑梗塞面积、脑组织病理损伤和脑组织水肿是评价脑损伤的常用指标,大脑中动脉闭塞可导致神经功能障碍[7]。本研究通过线栓法建立大鼠ACI模型后,首先观察到模型大鼠神经功能缺失评分、脑梗塞面积显著高于假手术组,且脑组织受损较为明显。阿替普酶联合红花提取物干预可显著改善神经功能缺失评分,减轻脑梗塞面积,改善脑组织病理损伤。提示阿替普酶联合红花提取物对ACI具有神经保护作用。

据报道,Bcl-2家族蛋白可调节线粒体凋亡信号的激活,其机制与调节线粒体外膜通透性有关[8]。Bcl-2具有抗细胞凋亡和延长细胞寿命作用,ACI后Bax的高表达拮抗Bcl-2作用,研究发现通过在脑缺血损伤后的不同时间增加Bax/Bcl-2比率,可使细胞易发生细胞凋亡[9]。本研究结果显示,ACI大鼠Bcl-2的表达显著降低,Bax的表达显著升高,表明ACI诱导细胞凋亡。经阿替普酶联合红花提取物治疗后,Bcl-2的表达显著上调,Bax的表达显著下调,暗示阿替普酶联合红花提取物抑制ACI细胞凋亡。此外,TUNEL细胞凋亡结果显示,ACI细胞凋亡率显著升高,阿替普酶联合红花提取物可显著降低细胞凋亡率。表明阿替普酶联合红花提取物对ACI的保护作用可能与抑制细胞凋亡有关。

TLRs是一种模式识别受体,可与病原体相关分子模式结合,在先天免疫和获得性免疫中发挥重要作用,TLR4是TLRs家族的成员之一,研究发现TLR4在脑缺血再灌注损伤模型中被显著激活[10]。此外,炎性小体在不同疾病中发挥关键作用,包括缺血性脑损伤、神经退行性疾病和自身免疫性疾病[11]。NLRP3炎症体是由NLRP3连接到caspase1上形成的大分子复合体,可被ATP、mtDNA、细菌和病毒成分等刺激激活。研究显示NLRP3炎症体可以被大脑中动脉阻塞激活,过度激活的NLRP3炎症体可以将失活的pro-caspase1转化为活性的caspase1,从而诱导IL-1β和IL-18促炎细胞因子的分泌[12]。TLR4可活化NF-κB,活化的NF-κB从细胞质转移至细胞核中,从而促进NLRP3的释放[13]。研究报道金合欢素可通过调节TLR4/NLRP3信号通路,实现对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用[14]。本研究得出类似结果,在本研究中,ACI大鼠中TLR4、NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65、caspase1、pro-IL-1β的表达显著增加,而阿替普酶联合红花提取物使TLR4、NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65、caspase1、pro-IL-1β的表达显著降低。提示阿替普酶联合红花提取物可能通过抑制TLR4-NLRP3信号通路进而起到对ACI的保护作用。

综上所述,ACI会诱发大脑中的细胞凋亡,损害神经功能,阿替普酶联合红花提取物可通过抑制TLR4-NLRP3信号通路及减少细胞凋亡,从而改善ACI受损的神经功能。揭示了阿替普酶联合红花提取物对ACI的神经保护功能的潜在机制,并暗示阿替普酶联合红花提取物可能是ACI的一种潜在治疗方法。