纳米复合材料免疫传感器的构建及其对肿瘤标志物CA72-4 的检测

闫清华,李宁宁,张文博,王佳欣,王歌

（1.新乡医学院生命科学技术学院,河南 新乡 453003；2.新乡医学院基础医学院,河南 新乡 453003）

癌症是最普遍的疾病之一,根据国际癌症研究机构（IARC）目前的统计结果来看,每五人一生中就有一人罹患癌症,而40%的癌症可以通过有效的预防措施得以避免,并且可以通过早期发现肿瘤来降低死亡率.由于癌细胞具有很强的移动性和侵袭性,在肿瘤被诊断出来很久之前就可以进入循环系统,因此为成功管理和控制癌症疾病,诊断和测量癌症的进展至关重要.由于癌细胞基因组变化与疾病过程的独特关联性,因此肿瘤标志物的应用在癌症诊断中起着关键作用.肿瘤标志物是一种能够反映肿瘤发生发展的生物标志物,主要发生于癌症产生期间,始发于肿瘤细胞,也可以是由宿主对肿瘤刺激而产生的一类能够被监测到的物质.生物标志物[1-4]获得途径比较简单,其通过体液就能获得,如血液样本（包括血清和血浆）、胃液、唾液、尿液、粪便等,肿瘤标志物在肿瘤发病期间的表达量变化有助于对肿瘤进行早期预测.已有肿瘤标志物的检测方法主要有酶标记免疫分析法、免疫发光分析法、放射免疫分析法以及生物传感器法,生物传感器作为一种电化学检测方法,因其简便的制备方法和高效的检测效率闻名.

生物传感器[5-8]是一种由生物元件组成的固态表面的设备,它可以与分析物进行生物特异性相互作用,并且传感器可以传导信号.生物传感器分类之一的免疫传感器,其生物元件是抗体或Ab 片段,利用抗原抗体特异结合作用形成免疫复合物这一原理,首先将抗体固定在纳米制备的载体上,材料之间可以通过化学键或相互作用进行连接,基于理化换能和信号放大原理将生物的信号转变为能够识别的电信号,用于检测待测标志物.该传感器检测快速、结果灵敏、准确度高,受到诸多科研者的研究和关注.

近年来的研究表明,纳米材料、纳米颗粒和导电聚合物在免疫传感器制造中的应用,使纳米生物传感器平台具有简单、灵敏、快速和特异的特点.由于纳米材料具备好的生物相容性、大的比表面积、能够通过化学键与抗原（抗体）进行结合等优点,因此其成为抗体结合载体的良好选择.纳米材料CoMOFs 具有很多孔隙和褶皱,可以通过Au-NH2结合更多的Au,Cu 是一种比较常见的化学物质,能够调节传感器的化学性能,在合成的纳米材料CoMOFs/CuAu 中,有大量的Au 均匀地附着在CoMOFs 上,这样使得合成的CoMOFs/CuAu 具有比其他物质更大的比表面积、更好的生物相容性等结合抗体的优势.CoMOFs/CuAu的制作比较简单方便,能够增加与抗体的结合量,进而使抗原抗体更好地发生特异性结合反应,由离子还原成的金属Au 导电性比较好,能够增大传感器表面的电子传递速率,从而放大传感器的检测电流信号.用CoMOFs/CuAu 作为基底制作的免疫传感器具有制作方法简便、检测速度更快、灵敏度更高的特点.

本研究将纳米材料CoMOFs 与CuAu 结合,既可以得到分散性良好的纳米复合材料CoMOFs/CuAu,又可以通过金氨键（Au-NH2）连接大量生物分子,将该复合材料用作电极的基底材料,加上抗原- 抗体特异性结合的特性从而实现对肿瘤标志物的捕获, 材料间相互结合制备成一种检测CA72-4 的免疫传感器.利用CV、DPV、EIS 等方法对其进行表征检测,实现对目标物的高灵敏检测,以期为临床应用研究提供试验依据.

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

氯化铜（CuCl2）、抗坏血酸（AA）、2- 氨基对苯二甲酸（NH2-BDC）、N、N- 二甲基甲酰胺（DMF）、四氯金酸（HAuCl4·3H2O）、牛血清白蛋白（BSA）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）、磷酸二氢钠（NaH2PO4）、铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]）、亚铁氰化钾（K4[Fe（CN）6]）、尿酸（UA）、硝酸（HNO3）、硫酸（H2SO4）、无水乙醇（C2H6O）均购于上海麦克林生化科技有限公司.CA72-4,anti-CA72-4 购于上海新潮科技有限公司.

760C 电化学工作站, 上海辰华仪器公司；SB-100D 超声波清洗器, 新芝生物科技有限公司；85-2A磁力搅拌器、DZF6020 真空干燥箱均,上海一恒科学仪器有限公司；FE28 型pH 计,梅特勒- 托利多有限公司；CP225D 电子天平,德国赛多利斯集团.

1.2 电解液的配制

制备PBS 溶液：分别制备0.1 mol/L 磷酸氢二钠和0.1 mol/L 磷酸二氢钠,将其混合.

铁氰化钾溶液：制备5 mmol/L[Fe（CN）6]3-/4-和0.1 mol/L KCl,将其混合,缓慢摇动待全部溶解后避光放至50 mL 离心管中.

1.3 CoMOFs/CuAu 纳米复合材料的制备

把8 mg 的NaBH4溶解在4 mL 超纯冰水中,准备好磁力搅拌器,在500 r/min 搅拌下倒入到30 mL超纯冰水中,制备出含有2 mg 的CoMOFs,3.08 mg 的CuCl2,和180 μL 的HAuCl4·3H2O（5%,w/v）的4 mL 溶液；将制备好的NaBH4溶液与该溶液进行混合,在室温条件下用磁力搅拌器使其混合液充分反应5 min；反应结束后得到的纳米复合材料溶液先用离心机进行离心,沉淀物质用超纯水离心洗涤2 次；用封口膜封住管口,使其在真空干燥箱37 ℃条件下干燥过夜,制备出CoMOFs/CuAu.

1.4 电化学免疫传感器的构建

将裸玻碳电极（GCE 电极）用超纯水冲洗干净后分别用粒径为0.3 μm 和50 nm 的氧化铝（Al2O3）粉末画“8”字打磨抛光,正反顺序各100 圈；再使用乙醇溶液、硝酸溶液和超纯水分别超声5 min；接着运用电化学工作站的循环伏安法使电极在硫酸中进行多次扫描,使其活化直到保持稳定的状态；之后再将电极在空气中进行晾干,然后将10 μL 的CoMOFs/CuAu 纳米复合材料溶液滴涂在清洁的GCE 上,电极干燥后用超纯水轻轻洗去多余物质或其他干扰物,再进行晾干；之后将5 μL 的抗体溶液滴涂在以上电化学传感器表面,经过一段时间,CoMOFs/CuAu 与抗体结合之后,再用PBS 轻轻洗去未结合的抗体或其他杂质,接着取6 μL 的BSA 试剂涂到电极上,BSA 试剂可以消除CoMOFs/CuAu 上的非特异性吸附,进而防止影响试验的进行,经过一段时间后用PBS 轻轻洗去多余物质；再在其表面滴加稀释后的5 μL 抗原溶液,晾干后,用PBS 洗去没有结合的物质或其他杂质,在37 ℃条件下干燥后,即制成了免疫传感器Ag/BSA/Ab/CoMOFs/CuAu/GCE,放入冰箱中备用（图1）.

图1 免疫传感器制备流程Fig.1 The fabrication process of electrochemical immunosensor

1.5 电化学免疫传感器的检测过程

各检测过程均在含5 mmol/L[Fe（CN）6]3-/4-和0.1 mol/L KCl 的PBS 溶液中进行,各检测过程采用三电极工作体系进行,参比电极为甘汞电极,对电极为铂丝电极,工作电极为玻碳电极.利用循环伏安法、阻抗法和差分脉冲伏安法对其进行表征和检测,CV 要求电压为-0.4 V ～+0.8 V,扫描速率为0.1 V/s；EIS要求频率范围为0.1 ～100 000 Hz 和10 mV；DPV 在电压范围为0 V～0.6 V 和50 mV 的幅度下进行.将制备的Ag/BSA/Ab/CoMOFs/CuAu/GCE 电极作为工作电极在上述条件下进行一系列电化学检测.

2 结果与分析

2.1 纳米材料CoMOFs、CoMOFs/CuAu 的表征

制备的CoMOFs 和CoMOFs/CuAu 纳米材料分别用扫描电镜和透射电镜进行表征,由图2-a 和图2-b 可知,CoMOFs 具有很多孔隙和褶皱,含有较大的比表面积,在合成的CoMOFs/CuAu 中,有Au 附着其上可增大电子传递速率,而Cu 可以调整传感器的性能.用透射电镜对CoMOFs 和CoMOFs/CuAu 的形貌进行表征,由图2-c 和图2-d 可见更多的Au 附着在CoMOFs 上,而它的分布也比较均匀,Au 能够与-NH2 共价结合,从而使抗体更好地结合,这样能够提高传感器的稳定性和导电性,以及更好地检测出传感器电流信号的变化.

图2 纳米材料CoMOFs、CoMOFs/CuAu 的扫描电镜和透射电镜图Fig.2 SEMand TEMimage of CoMOFs、CoMOFs/CuAu

2.2 电化学免疫传感器的构建过程表征

为了对试验过程中电化学免疫传感器的构建过程进行表征,使用CV 法对各孵育步骤之后的修饰电极的传感界面性质进行测量.结果如图3-a 所示,曲线a 是未作修饰的裸电极的CV 结果,可以观察到一对明显的可逆氧化还原峰；曲线b 显示了CoMOFs/CuAu 修饰电极的结果,由于材料的导电性能较低致使氧化还原峰的电流下降；接着,滴涂的抗体通过氨基与复合材料结合修饰到电极上,由于抗体是大分子蛋白质,会阻碍电子传递,使得电极表面的电阻进一步增加,所以降低了氧化还原峰电流（曲线c）；同样地,当用BSA 封闭Ab/CoMOFs/CuAu/GCE 的非特异性位点时,由于大分子蛋白质阻碍了电子传递,峰电流值会进一步降低（曲线d）；最后,由于抗原- 抗体特异性结合生成的免疫复合物会产生高电阻阻碍电子传递,因此抗原蛋白CA72-4 和抗体结合后峰值电流降低到最小值（曲线e）.

图3 电极修饰过程的电化学表征图Fig.3 Electrochemical characterization diagram of electrode modification process

为进一步验证上述试验结果,运用EIS 法作出了电化学阻抗谱的奈奎斯特（Nyquist）图,如图3-b 所示,很容易看出,CoMOFs/CuAu 修饰电极（曲线b）的EIS 与裸GCE（曲线a）相比阻抗略微增大；抗体被修饰以后可以看到阻抗明显增大（曲线c）,由于抗体由生物大分子组成,会阻挡电极表面传递电子；BSA 主要是将非特异性的结合位点封闭,阻抗依然增大（曲线d）；最后抗原特异性结合抗体,进一步阻碍电子传递,阻抗也进一步增大（曲线e）.由EIS 图像与CV 图结果来看,二者相互印证,因此证明了免疫传感器的每一个制备过程都是成功的.

2.3 电化学免疫传感器扫速的优化

为验证免疫传感器表面的电化学控制过程,我们将免疫传感器在含有5 mmol/L[Fe（CN）6]3-/4-和0.1 mmol/L KCl 的PBS 溶液中做了不同扫描速率的CV 表征,结果如图4-a 所示.由图4-b 可以看出传感器扫描图像具有明显的氧化还原峰,且随着扫速增大,氧化还原峰增大.图4-b 显示的是氧化还原峰电流与扫描速率平方根的线性关系,线性关系分别为y=1.57x+37.34 和y=-1.42x-34.00,相关系数均为0.99.证明该传感器在溶液中是由扩散控制的.

2.4 免疫传感器检测条件的优化

电化学试验容易受到多种条件影响,为使电化学检测性能稳定,检测结果可靠,我们对抗原孵育时间、检测溶液pH 等试验条件进行优化.

抗原抗体结合是试验中最为关键的步骤,若孵育时间过短,抗原抗体结合形成的免疫复合物量就会过少,检测的准确性就会大大降低.如图5-a 所示,随着孵育时间增加,传感器响应电流空白电极和结合之后电流差值逐渐增大,在40 min 之后电流变化量趋于平稳,这表明在40 min 之后抗原抗体结合量达到最大值,电极捕获抗原能力达到最大值,所以我们选定40 min 为最佳孵育时间.

图5 免疫传感器检测条件的优化Fig.5 Optimization of the experimental conditions for the immunosensor

由于电极捕获的大分子物质为活性蛋白,其化学性质受电解液pH 影响,这是因为在高酸或高碱环境中复合材料催化能力减弱,同时大分子活性材料的活性会下降.我们设置不同pH 梯度的铁氰化钾溶液,用于检测传感器性能.如图5-b 所示,随着pH 逐渐变化,电流的响应量是先升高然后再降低,pH 为6.5 时响应电流最高,因此试验的最适pH 为6.5.

2.5 电化学免疫传感器的性能分析

2.5.1 检测范围和检测限在最优试验条件下,用DPV 法在铁氰化钾溶液中测定不同浓度的糖蛋白抗原72-4 在免疫传感器上的电流响应,试验结果如图6 所示,图6-a 可以看出随着抗原浓度升高,峰电流值下降；在图6-b 中,空白电极和修饰抗原后的DPV 电流差值随抗原浓度的增大而增加,在0.001 ～100 μmol/min·mL的范围内,空白电极和孵育抗原之后的免疫电极的DPV 的峰电流差与抗原浓度的对数呈线性关系,其线性方程为：△I（μA）=3.44（lg[C]+76.79（R2=0.99）,根据计算公式3σ/b（σ 为空白电极响应的标准差,b 为响应方程的斜率）计算得出最低检测限为：0.007 μmol/min·mL（S/N=3）.

图6 免疫传感器的检测范围测定Fig.6 Determination of detection range of immunosensors

对比其他文献资料如表1 所示,该研究制备的免疫传感器具有较宽的检测范围和较低的检出限.这主要是由于CoMOFs 较大的比表面积为CuAu 提供了更多的结合位点,使得后者结合抗体能力更强,更易于抗原抗体免疫复合物的形成,即使浓度较低的抗原也能被捕获.该免疫传感器成本很低、方便制备,操作简单,发展前景很大.

表1 本试验构建的传感器线性范围和检测限与其他检测方法的对比Tab.1 Comparison of the linear range and the limit of detection of other immunosensors

2.5.2 选择性、重复性和稳定性选择性是传感器性能分析的关键因素之一,目的是为了排除非特异性蛋白相互作用的DPV 响应.试验中在优化的条件下检测了有可能作为干扰因素的目标物体系,如抗坏血酸、L- 半胱氨酸、尿酸、CEA 等.如图7-a 所示（展示了空白电极、CEA、抗坏血酸、L- 半胱氨酸、尿酸及几种干扰物质的混合溶液所测得的电化学信号）.所有干扰物的浓度均为10 ng/mL,CA72-4 的浓度为1 μmol/min·mL.结果可以看出,无目标物溶液中的DPV 响应信号明显低于含目标物CA72-4.另外测定干扰成分与目标物混合的溶液,响应信号未明显下降.这表明了该免疫传感器选择性能十分良好.

图7 免疫传感器的性能检测Fig.6 Performance testing of immunosensors

制备多支免疫传感器评价其重复性.如图7-b 所示,对1 μmol/min·mL的CA72-4 的检测结果进行批内和批间的测定,测定结果显示几次结果的相对标准偏差（RSD=3.82%）均不超过5%,表明制备的免疫电极具有良好的重复性.

将组装好的免疫电极放在4 ℃冰箱中保存,在存放后的第4、8、12 天分别对其DPV 响应电流进行检测,结果如图7-c 所示,12 d 以后电流响应变化的计算结果变化的标准差为3.8%.以上结果表明,该免疫传感器的稳定性是可以被接受的.

2.6 实际样品的检测

为了检测所制备的免疫传感器在临床应用中的价值,用人血清作为样本,用制备的免疫传感器检测其中含有的CA72-4 浓度,试验结果如表2 所示.然后取三份样品,分别加入标准浓度为5 μmol/min·mL、10 μmol/min·mL、20 μmol/min·mL的抗原,经免疫传感器检测后用得到的结果计算加标回收率.如表2所示,免疫传感器的加标回收率在100.3%～106.6%之间,RSD 在2.36%～4.17%之间.

表2 传感器测定样品中CA72-4 的回收率（N=3）Tab.2 Determination of CA72-4 in real samples（N=3）

3 结论

本论文以CoMOFs/CuAu 为电极基底层,构建了一种简单的电化学免疫传感器.CoMOFs/CuAu 可以提高GCE 比表面积和生物相容性,为抗体的固定化提供了大量的官能团,进一步改善了修饰电极的电化学性能,具有捕获抗原能力强、灵敏度高的优势.经检测的试验结果显示该CA72-4 电化学免疫传感器的线性响应范围为0.001～100 μmol/min·mL,检测限为0.007 μmol/min·mL（S/N=3）,且具有较好的选择性、重现性和稳定性.该免疫传感器为临床标本中生物标志物的敏感分析提供了一个很有前景的平台,对疾病的早期识别、治疗和预后监测具有重要意义.