宏基因组二代测序在肺结核诊断中的应用

唐小莉 戴广川 高卫卫 陈珊珊 曾谊

目前我国每年新发肺结核患者约90万例[1],结核病仍是我国传染病死亡主要原因,及早诊断、及时治愈是消除传染源、控制结核病流行及降低死亡率的最重要措施。目前的病原学诊断工具包括抗酸杆菌涂片、微生物培养、Xpert MTB/RIF(Xpert)、全基因组测序等分子检测。mNGS是一种新型、快速、简单、方便的临床感染性疾病鉴定的检测方法[2],只需一次运行即可无偏倚地获得所有获得微生物核酸片段的序列信息,通过分析和比较可鉴定所有微生物物种[3]。在这项研究中,我们回顾性分析91例疑似肺结核患者BALF的传统病原体检测方法与mNGS结果并进行对比,评估mNGS在肺结核诊断中的临床价值。

资料与方法

一、一般资料

收集2020年12月至2021年6月在南京市第二医院收治的91例疑似肺结核患者,从每位患者的BALF中取样分别送检mNGS(诺因生物,南京)、涂片、培养、Xpert,参照《肺结核诊断》(WS 288—2017)[4]以确定最终临床诊断,包括临床诊断肺结核和确诊肺结核。

二、纳入及排除标准

纳入标准:(1)门诊经痰涂片初步筛查为阴性的疑似肺结核患者。(2)临床资料完整无缺失。(3)临床样本和检测过程通过mNGS的质量控制。

排除标准:(1)临床和实验室资料不完整。(2)诊断不明确。(3)临床样本未通过 mNGS 质量控制。(4)样品泄漏和污染。

本研究所有患者均已获得知情同意书,并通过南京市第二医院伦理委员会审批(2021-LY-kt073)。

三、方法

1 标本采集:纳入患者的BALF。2 常规检测方法:涂片按照《结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册》进行。培养采用BACTECMGITTM960分枝杆菌快速培养法[5]。Xpert按照利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测系统仪器使用说明书进行操作(美国Cepheid公司),检测结果自动判读。3 mNGS:根据标准程序采集纳入患者的BALF 1.5～3 mL,储存无菌冻存管中,24小时内进行检测。样本按照TIANamp Micro DNA Kit(DP316,Tiangen Biotech)试剂盒步骤提取DNA处理产生200～300 bp片段,通过PCR 扩增和环化反应产生单链环来构建文库,Agilent 2100 用于质量控制,通过 BGISEQ-200平台对质量确认的文库进行测序,排除人源序列后的其余数据与KnoinDXTM建立的基于NCBI(GenBank/RefSeq/NT)的微生物参考数据库对比进行高级数据分析。本研究使用的参考数据库包含10216 种细菌、5875 种病毒、3789 种真菌和432 种寄生虫。结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)阳性mNGS 结果的阈值标准:MTB是一种胞内分枝杆菌病原体,核酸提取困难,且BALF污染可能性小,因此当至少1个读数被映射到种水平时MTB被认为是阳性[6]。

四、统计学分析

非正态分布的连续变量表示为中位数(四分位数间距),正态分布的连续变量表示为均值(标准差),分类变量表示为n(%)。组间差异采用Mann-WhitneyU检验、卡方检验或Fisher精确检验。以临床最终诊断为参考标准,建立 2×2 列联表以确定敏感度、特异度、阳性预测值 (PPV) 和阴性预测值 (NPV),结果以 95% 置信区间 (CI)表示,mNGS与其他检测方法的敏感差异性用Mcnemar χ2检验。使用SPSS 25.0软件、MedCalc V19.0.7.0软件和Graphpad Prism 8软件进行数据分析。P<0.05 为具有统计学意义,所有检验均采用双尾检验。

结 果

一、患者基本信息

共有91名患者符合本研究的纳入标准,男性53例(58.24%),年龄中位数(四分位区间)为52.00(28.50,63.00)岁;女性38例(41.76%),年龄均值(标准差)为(51.00±16.88)岁。其中73例 (80.22%) 诊断为肺结核,男性43例(58.90%),年龄中位数(四分位区间)为49.00(26.00,63.00)岁,女性30例(41.10%),年龄均值(标准差)为(51.07±17.62)岁。18例(19.78%)患者诊断为非结核感染性疾病,男性10例(55.56%),年龄均值(标准差)为(55.40±17.43)岁,女性8例(44.44%),年龄均值(标准差)为(50.75±14.84)岁。两组患者的年龄、性别、实验室参数、症状等方面均无统计学差异(P>0.05)。

二、不同检测手段在肺结核诊断中的效能

在73例肺结核患者中,mNGS共检出MTB阳性28例。mNGS与涂片、培养、Xpert检出均阳性的病例仅1例;mNGS与涂片均阳性为9例、与培养均阳性为6例、与Xpert均阳性为17例;仅mNGS阳性为9例,仅涂片阳性为1例,仅Xpert阳性为12例。mNGS诊断肺结核的敏感度和特异度分别为38.36%(95%CI0.272～0.505)和100.00%(95%CI0.815～1.000),PPV和NPV分别为100.00% (95%CI0.877～1.000)和28.57% (95%CI0.179～0.413);涂片法的敏感度和特异度分别为15.07%(95%CI0.078～0.254)和77.78%(95%CI0.524～0.936);培养法的敏感度和特异度分别为10.96%(95%CI0.049～0.205)和100.00%(95%CI0.815～1.000);Xpert的敏感度和特异度分别为41.10%(95%CI0.297～0.532)和94.44%(95%CI0.729～0.999)。本组研究结果示mNGS敏感度略低于Xpert,两者之间无显著性差异(38.36%vs41.10%,P=0.84;);与涂片和培养相比,mNGS的敏感度分别增加(38.36%vs15.07%;P<0.001),(38.36%vs10.96%;P<0.001),其P值均<0.001,两者之间存在显著性差异。将Xpert和mNGS两种快速诊断方法结合起来,发现可有效提高肺结核检测的敏感度,其敏感度可达56.16% (95%CI0.441～0.678),联合诊断效能优于四种方法中的任何一种(表1)。

表1 mNGS与涂片法、MTB培养、Xpert在肺结核诊断中的比较(%)

三、不同检测手段在肺结核复诊患者中的诊断效能

将所有纳入的91例疑似肺结核病患者根据有无抗结核治疗史分为初诊病例和复诊病例两组。与初诊病例相比,复诊病例组的涂片(20.00%vs7.14%,P=0.07)和mNGS(57.14%vs42.86%,P=0.19)检测敏感度提高,培养(14.29%vs16.07%,P=0.82)和Xpert(22.86%vs39.29%,P=0.11)检测敏感度降低,但均无显著性差异。其复诊病例中,mNGS的敏感度为57.14%,涂片的敏感度为20.00%,培养的敏感度为14.29%,Xpert的敏感度为22.86%。mNGS与涂片(57.14%vs20.00%,P<0.001)、培养(57.14%vs14.29%,P<0.001)、Xpert(57.14%vs22.86%,P<0.001)之间的敏感度对比均有显著性差异(表2)。

表2 mNGS与涂片、MTB培养、Xpert在初诊与复诊病例中的敏感度比较[n(%)]

四、不同检测手段对不同抗结核治疗时间复诊患者的诊断效能

在35例复诊患者中,根据患者抗结核治疗是否超过6个月分为两组。抗结核治疗时间 ≤ 6个月的患者中,mNGS敏感度分别与涂片(61.54%vs38.46%,P=0.38)、培养(61.54%vs23.08%,P=0.18)、Xpert(61.54%vs53.85%,P=1.00)均未有显著性差异,且mNGS与涂片、培养、Xpert的联合诊断敏感度相当(61.54vs76.92%,P=0.63);但在抗结核治疗时间 >6个月的患者中,mNGS的敏感度为54.55%,涂片的敏感度为9.09%,培养的敏感度为9.09%,Xpert的敏感度为4.55%,涂片、培养、Xpert的联合诊断敏感度为22.73%。mNGS敏感度与涂片(54.55%vs9.09%,P<0.001)、培养(54.55%vs9.09,P<0.001)、Xpert(54.55%vs4.55,P<0.001)的P值均<0.001,两者之间均有显著性差异,且mNGS敏感度大于涂片、培养、Xpert的联合诊断(54.55%vs22.73%,P=0.07)。而且,在抗结核治疗时间≤6个月的患者中,MTB与其他病原体混合感染占比15.38%(2/13);非结核感染患者占比15.38%(2/13),培养和mNGS各检出1例致病菌;在抗结核治疗时间>6个月的患者中,MTB与其他病原体混合感染占比27.27%(6/22);非结核感染患者占比36.36%(8/22),mNGS均检出非结核感染患者的致病菌,涂片与Xpert均未检出,培养仅检出2例(表3)。

表3 mNGS与涂片、MTB培养、Xpert在不同抗结核治疗时间复诊病例中的敏感度比较[n(%)]

五、mNGS对肺结核合并混合感染的诊断效能

在73例肺结核患者中,mNGS结合常规检查方法共诊断出混合感染18例(24.66%)。7例为MTB和真菌混合感染(黑曲霉1例、隐球菌1例、白色念珠菌1例、土曲霉2例、烟曲霉2例),3例为MTB和常见细菌混合感染(副流感嗜血杆菌1例、肺炎克雷伯杆菌1例、巴西奴卡菌1例),5例为MTB和非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacterium,NTM)混合感染(鸟分枝杆菌2例、胞内分枝杆菌1例、龟分枝杆菌2例),2例为MTB和病毒混合感染(人疱疹病毒1例、戊肝病毒1例),1例为MTB和真菌、病毒混合感染(出芽短梗霉、人疱疹病毒)。混合感染患者中,除MTB外其它病原体均由mNGS检出。其中6名患者(6/18,33.33%)仅使用mNGS方法同时检测出MTB、真菌和NTM(隐球菌、白色念珠菌各1例,鸟分枝杆菌2例、胞内分枝杆菌1例、龟分枝杆菌1例)。整体而言,与常规培养和Xpert相比,mNGS在鉴定混合感染、NTM菌种以及真菌、病毒检测方面具有明显优势。

讨 论

目前,传统病原微生物检测方法在临床肺结核病的诊断中仍在广泛应用,但在敏感度、特异度、时效性及信息量等方面存在一定的局限性,尤其对未知或罕见病原体无法进行快速识别。其中抗酸染色涂片法仅能提示分枝杆菌感染,其灵敏度仅30%,且无法对MTB与NTM进行判别。MTB培养法虽敏感性有所提高,但需2～6周才能提供检测结果。Xpert通过rpoB基因互补的探针虽然在2小时内能同时识别MTB和利福平(RIF)耐药性[7],但无法检测NTM及进行菌种鉴定。本研究结果显示mNGS与涂片、MTB培养相比,在肺结核诊断中敏感度具有显著性差异(38.36%vs15.07%;P<0.01;38.36%vs10.96%,P<0.01),这与之前的研究一致[8-9];与Xpert相比,其敏感性略低,但两者之间无显著性差异(38.36%vs41.10%,P=0.84)。将Xpert和mNGS联合诊断进行分析,数据表明有效提高结核病检测的敏感度。在时效性方面mNGS周转时间为24小时,长于Xpert 2小时,明显短于MTB培养,与涂片时间相当。整体而言,在肺结核的早期诊断中mNGS较传统病原学检测方法具有一定优势,尤其与Xpert联合诊断时敏感度更高。

本研究结果显示mNGS有助于肺结核患者的混合病原体诊断及非结核患者的其他病原体诊断,与之前mNGS对混合肺部病原体检测具有比常规检测更高的灵敏度[10-11]的相关报道相符。病毒检测常需临床医生预判并进行相关血清免疫学及PCR核酸检测[12]进行诊断,在本研究中发现的两例病毒感染仅通过mNGS得到鉴定,本结果进一步突出mNGS在识别单个标本中致病病原体方面的优势,本组标本尤其在鉴定NTM菌种、真菌与病毒方面具有优越的可行性,与mNGS在结核、真菌、病毒诊断方面比传统培养更有优势[6]。机体被结核感染后细胞免疫功能受损易继发NTM、真菌(曲霉、肺孢子菌、隐球菌等)、病毒(巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒等)、军团菌、诺卡菌等感染[13],鉴于相关致病菌核酸提取率低,故在无菌操作获取的BALF标本中检测出的上述病原体尽管序列数低仍需考虑其致病可能[14],且由于抗菌药物使用对mNGS的影响小于传统培养,故建议根据检测结果可以进行抗菌药物治疗方案的调整[6]。文献报道肺结核死亡的主要原因中肺结核合并感染死亡率最高[15]。mNGS可以早期发现可能致病病原体,指导抗菌药物的精准选择,从而有望降低肺结核患者的病死率,但尚需要大样本的研究证实。

由于抗结核药物抑制了结核菌的生长,故有结核药物治疗史的患者常规涂片、培养法MTB阳性检出率较无治疗史者降低,而mNGS检出MTB阳性率无显著差异[16]。我们根据患者有无抗结核治疗史将所纳入患者分为初诊病例和复诊病例两组,我们的结果也表明,mNGS检出效率不受之前使用抗结核药物的影响(57.14%vs42.86%,P=0.19)。在复诊病例中,除mNGS与涂片、培养的检测效率均有显著性差异外,mNGS与Xpert也存在显著性差异(57.14%vs22.86%,P<0.01),我们数据表明mNGS可有效提高复诊病例的诊断效率。在复诊病例的基础上,根据患者抗结核治疗时间是否超过6个月进一步分为两组。发现在抗结核治疗时间≤ 6个月患者中,各检查方法敏感度相当,而在>6个月的患者中mNGS敏感度均大于涂片、培养、Xpert及三者的联合检测,同时非结核感染患者(36.36%vs15.38%)及MTB与其他病原体混合感染患者(27.27%vs15.38%)占比均高于与对照组,提示规范抗结核治疗后MTB被有效扼杀,同时因结核感染后肺部结构改变,局部廓清功能及免疫功能下降易继发混合感染。数据表明mNGS可有效提高复诊病例的诊断效率,评估是否复发,为复诊患者及时精准诊治提供了一种可能,且可能更适用于抗结核治疗时间>6个月的复诊患者,避免了非活动性肺结核患者的过度治疗,同时可成为复诊患者分诊指标,以决定患者是否能入住非结核病定点医疗机构就医。

综上所述,mNGS在肺结核早期诊断中敏感度优于涂片法、培养法,与Xpert检测相当,与Xpert联合诊断敏感度更高;在肺结核合并混合感染方面具有优势;可用于肺结核复诊患者评估是否复发,值得推广应用。在这项回顾性研究仍有许多局限性。首先,由于样本量小,有部分结果表明了一定的趋势,但没有达到差异显著性。因此,未来需要纳入更多的患者进行研究。其次,本研究只进行了mNGS DNA检测,未进行 RNA 测序;因此有可能遗漏一些RNA病毒。最后,mNGS目前尚缺乏统一的标准来确定检测到的病原微生物是否来自感染、定植或污染,故结果需与临床相结合。